CDs表達(dá)的TLR4-9在約氏瘧原蟲(chóng)感染早期的免疫調(diào)控作用.pdf

1、瘧疾是由瘧原蟲(chóng)感染引起的最為嚴(yán)重的寄生原蟲(chóng)感染性疾病。嚴(yán)重的瘧疾疫情正是造成發(fā)展中國(guó)家兒童高死亡率和成人高發(fā)病率的主要原因。而瘧原蟲(chóng)抗原變異和耐藥性原蟲(chóng)的出現(xiàn)，又進(jìn)一步阻礙了瘧疾疫苗的研制和抗瘧藥物的開(kāi)發(fā)。因此，尋求新的瘧疾疫苗靶點(diǎn)將無(wú)疑是瘧疾控制的重中之重。
　　 嚙齒類瘧原蟲(chóng)感染小鼠為深入探討抗人瘧保護(hù)性免疫應(yīng)答機(jī)制，提供了一種寶貴的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。約氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumyoelii17XL，P.y17XL)感染的不

2、同小鼠，會(huì)呈現(xiàn)不同的Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答模式，因而導(dǎo)致其出現(xiàn)自愈和死亡兩種截然相反的感染結(jié)局。因此，瘧疾感染早期Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答的有效建立明顯影響著感染進(jìn)程和最終結(jié)局。在這一過(guò)程中，DCs是決定Th免疫應(yīng)答的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。作為活化樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)眾多效應(yīng)分子之一的Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）對(duì)于其成熟和功能發(fā)揮起著舉足輕重的作用。同時(shí)嚙齒類研究表明，TLR2/4可通過(guò)

3、識(shí)別瘧原蟲(chóng)錨定在糖復(fù)合物上的糖基化磷酯酰肌醇（glycosylphospatidylinositol，GPI）誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生，而瘧原蟲(chóng)成份之一的瘧色素可通過(guò)TLR9啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答。
　　 我們利用成功建立的P.y17XL感染的BALB/c和DBA/2鼠瘧模型，分析了參與抗瘧免疫應(yīng)答調(diào)控的相關(guān)因素。前期的研究結(jié)果顯示，兩種不同易感性的小鼠在感染過(guò)程中，TLR4/9表達(dá)程度不盡相同。本研究通過(guò)外源性給予TLR4/9激動(dòng)劑或抑制劑

4、，動(dòng)態(tài)觀察其對(duì)于不同易感性小鼠感染模式及結(jié)局的影響、免疫效應(yīng)細(xì)胞及產(chǎn)生細(xì)胞因子的變化，以期為瘧疾疫苗開(kāi)發(fā)提供新的靶點(diǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、瘧原蟲(chóng)及主要試劑
　　 6～8周齡、雌性BALB/c小鼠、DBA/2小鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供（許可證編號(hào)：SCXK京200420001）；P.y17XL（同本愛(ài)媛大學(xué)分子寄生蟲(chóng)學(xué)教研室惠贈(zèng)）；LPS購(gòu)自Sigma公司(St. Louis，MO，

5、USA)；TLR9激動(dòng)劑CpG1826及其對(duì)照組CpG1982（Takara合成）；TLR9抑制劑H154及其對(duì)照組A151(Takara合成)。
　　 2、動(dòng)物分組與TLR4/9激動(dòng)劑抑制劑處理及感染
　　 (1)P.y17XL不同易感程度鼠瘧模型：易感型BALB/c小鼠和抵抗型DBA/2小鼠；
　　 (2)TLR9激動(dòng)劑及其對(duì)照組處理組模型：感染前2d，分別經(jīng)脛骨前肌肉注射給易感型BALB/c小鼠：TLR9激

6、動(dòng)劑易感型BALB/c小鼠；CpG1826，50μg/只；TLR9激動(dòng)劑對(duì)照組CpG1982，50μg/只；
　　 (3)TLR4激動(dòng)劑處理組模型：感染后第2d易感型BALB/c小鼠經(jīng)鼠尾靜脈注射TLR4激動(dòng)劑LPS，25μg/只；
　　 (4)TLR9抑制劑及其對(duì)照組處理組模型：感染前1d，分別經(jīng)腹腔注射給予抵抗型DBA/2小鼠：TLR9抑制劑H154，3mg/kg;TLR9抑制劑對(duì)照組A151，3mg/kg;

7、　　 上述小鼠分別經(jīng)腹腔感染1×106P.y17XL寄生的紅細(xì)胞，感染不同時(shí)間小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率，并每同觀察生存率。
　　 3、脾細(xì)胞培養(yǎng)
　　 不同鼠瘧模型小鼠于感染0d、3d和5d常規(guī)無(wú)菌摘取脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液。用含10％FCS的RPMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度至1×107個(gè)/ml，24孔培養(yǎng)板(FALCON)，每孔加入500μl細(xì)胞懸液，一式3孔，培養(yǎng)4

8、8h。350×g室溫離心10min，收集上清，-80℃保存，待細(xì)胞因子測(cè)定。
　　 4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠脾臟細(xì)胞檢測(cè)
　　 FACS檢測(cè)CD11c+TLR4+DCs、CD11c+TLR9+DCs、CD11c+CD11b+DCs(mDCs)、CD11c+B220+DCs(pDCs)、CD4+CD69+T細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞(Tregs)。
　　 5、細(xì)胞因子檢測(cè)
　　 雙抗體夾心EL

9、ISA法對(duì)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-10的含量分別進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀(InterMedNJ-2100)測(cè)定450nm處OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，標(biāo)本采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、TLR4/9激動(dòng)劑對(duì)P.y17XL感染BALB/c小鼠感染模式的影響
　　

10、TLR4激動(dòng)劑LPS處理組，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠原蟲(chóng)血癥水平緩慢上升，于感染后第16d達(dá)到峰值，峰值為21.12％，生存率為66.67％。TLR9激動(dòng)劑處理組，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠原蟲(chóng)血癥水平迅速持續(xù)升高，一同于感染后第5d達(dá)到60～70％，并于感染后第5d-7d全部死亡。
　　 2、TLR4/9激動(dòng)劑對(duì)抗Py17XL感染免疫過(guò)程中相關(guān)免疫細(xì)胞的影響
　　 與感染前相比，P.y17XL感染后第3d和5d，正常感染組小鼠

11、脾臟表達(dá)TLR9的DCs細(xì)胞、DCs亞群及Tregs均顯著升高，脾臟表達(dá)TLR4的DCs和脾臟細(xì)胞內(nèi)CD4+CD69+T細(xì)胞未見(jiàn)有意義的變化。感染后3d和5d，TLR4激動(dòng)劑LPS處理組小鼠脾臟表達(dá)TLR4的CD11c+DCs、DCs亞群及CD4+CD69+T細(xì)胞百分比顯著高于正常感染組小鼠，Tregs百分比顯著低于正常感染組。TLR9激動(dòng)劑處理組小鼠脾臟表達(dá)TLR9的CD11c+DCs百分比顯著高于正常感染小鼠及對(duì)照組。DCs亞群、C

12、D4+CD69+T細(xì)胞及Tregs與之相比未見(jiàn)有意義的改變。
　　 3、TLR4/9激動(dòng)劑對(duì)P.y17XL感染免疫過(guò)程中相關(guān)免疫分子的影響
　　 與感染前相比，P.y17XL感染后第3d和5d，正常感染組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-10分泌顯著升高。感染后3d和5d，TLR4激動(dòng)劑LPS處理后的感染小鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ顯著高于正常感染組，IL-10的分泌量顯著低于正常感染組。TLR9激動(dòng)

13、劑與之相比脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及IL-10未出現(xiàn)有意義的變化。
　　 4、TLR9抑制劑對(duì)P.y17XL感染DBA/2小鼠感染模式的影響
　　 經(jīng)P.y17XL感染后第2d，所有小鼠外周血中均出現(xiàn)瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞。未經(jīng)TLR9抑制劑H154處理的小鼠原蟲(chóng)血癥水平上升平緩，于第6d和第14d達(dá)到峰值，峰值分別為15.56和15.57。隨后小鼠全部自愈。而經(jīng)TLR9抑制劑H154處理的小鼠，原蟲(chóng)血癥水平上升迅速，于感

14、染后第11d才達(dá)到峰值，峰值為39.47％，隨后原蟲(chóng)血癥水平下降，至感染后第19d部分小鼠自愈，小鼠生存率為33.33％。
　　 5、TLR9抑制劑對(duì)P.y17XL感染免疫過(guò)程中相關(guān)免疫細(xì)胞的影響
　　 與感染前相比，P.y17XL感染后第3d和5d，正常感染組小鼠脾臟表達(dá)TLR9的DCs細(xì)胞、DCs亞群、CD4+CD69+T細(xì)胞及Tregs均明顯升高。感染后第3d，TLR9抑制劑處理組小鼠脾臟表達(dá)TLR9的CD11c+

15、DCs及CD4+CD69+Tcells百分比顯著低于正常感染及對(duì)照組。感染后第3d和5d，TLR9抑制劑處理組小鼠脾臟DCs亞群的百分比顯著低于正常感染及對(duì)照組。感染后第5d，TLR9抑制劑處理組小鼠脾臟Tregs的百分比顯著低于正常感染及對(duì)照組。
　　 6、TLR9抑制劑對(duì)P.y17XL感染免疫過(guò)程中相關(guān)免疫分子的影響
　　 與感染前相比P.y17XL感染后第3d，正常感染組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-10分