副溶血弧菌海產(chǎn)品分離株的致病性和主要毒力基因結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、副溶血弧菌廣泛分布于世界各地,是一種常見的海產(chǎn)品污染菌之一。該病原菌主要導(dǎo)致胃腸炎和敗血癥。副溶血弧菌的致病性與熱穩(wěn)定直接溶血素(Thermostable direct hemolysin,TDH,編碼基因tdh)和TDH相關(guān)溶血素(Thermostable-related hemolysin,TRH,編碼基因trh)有關(guān)。但并不是所有副溶血弧菌分離株都有致病性,目前為止環(huán)境和海產(chǎn)品分離株及臨床分離株主要毒力基因的分布及其致病能力的相關(guān)

2、性尚不清楚。大部分臨床分離株都具有由TDH引發(fā)的神奈川現(xiàn)象(Kanagawa phenomenon,KP),只有少數(shù)環(huán)境和海產(chǎn)品分離株出現(xiàn)此現(xiàn)象。另外,攜帶trh基因的分離株均具有尿素酶表型。很多血清型的副溶血弧菌均可攜帶tdh和/或trh基因。自1996年在Clcata,印度發(fā)現(xiàn)新O3:K6流行株以來(lái),亞洲和美國(guó)等多次爆發(fā)由該血清型引起的胃腸炎中毒事件。其它血清型如O4:K48,O4:K68,O1:K25也有潛在的致病能力,而且與O3

3、:K6親緣關(guān)系相近。因此,分離和收集不同來(lái)源的副溶血弧菌環(huán)境和海產(chǎn)品分離株以及臨床分離株,比較其毒力基因的分布及結(jié)構(gòu)特征并對(duì)其進(jìn)行分型,有助于我們更好地了解副溶血弧菌的致病機(jī)理及其分子生態(tài)特征,從而可提出控制策略,有效預(yù)防副溶血弧菌病的發(fā)生。
　　 從5個(gè)不同海產(chǎn)品加工廠和杭州海產(chǎn)品零售市場(chǎng)共采樣766份,包括新鮮、冷凍和成品海產(chǎn)品以及海產(chǎn)品加工環(huán)節(jié)中的環(huán)境樣品。經(jīng)過(guò)堿性蛋白胨水的預(yù)增菌和選擇性培養(yǎng)基(TCBS)的初步鑒定后,以

4、具有副溶血弧菌種特異性的不耐熱溶血素基因tlh和旋轉(zhuǎn)酶B基因gyrB為靶目標(biāo)進(jìn)行雙重PCR鑒定。檢測(cè)結(jié)果顯示163株(163/766,21.3％)為副溶血弧菌。上述結(jié)果表明,新鮮、冷凍海產(chǎn)品及其加工環(huán)境中均存在具有潛在致病性的副溶血弧菌。
　　 比較三種不同限制性內(nèi)切酶(ApaⅠ、SmaⅠ和NotⅠ)對(duì)54株副溶血弧菌環(huán)境、海產(chǎn)品和臨床分離株進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型。結(jié)果表明.NotⅠ的分型效果優(yōu)于ApaⅠ或SmaⅠ,

5、在54株分離株中,有49株具有可分型性,而另外5株不能被分型。經(jīng)PFGE指紋圖譜分析,可將所有菌株劃分為11個(gè)脈沖型(分別為A至K)。參考株BJ1997和5株海產(chǎn)品分離株屬于Ⅰ脈沖型,其它環(huán)境和海產(chǎn)品分離株則分別屬于A至H、J和K PFGE型。臨床分離株主要集中于A、B、D、E、G和K脈沖型。B型為主要的脈沖型,包含4株臨床分離株和4株海產(chǎn)品分離株,同時(shí)它又可分為3個(gè)亞型,其中2株臨床分離株(ZJ1和ZJ5)和2株海產(chǎn)品分離株((ZJ6

6、和ZJ7)分別屬于B1和B3亞型。上述結(jié)果暗示杭州地區(qū)的食物中毒事件可能因食用未煮熟的已污染副溶血弧菌的海產(chǎn)品所致。同時(shí)也表明PFGE分型體系可用于不同來(lái)源副溶血弧菌的遺傳多樣性研究。
　　 為深入了解不同來(lái)源副溶血弧菌的表型特征及基因分布情況,本研究對(duì)263株副溶血弧菌(包括4株參考菌株,32株臨床株和227株環(huán)境和海產(chǎn)品分離株)進(jìn)行表型分析和毒力相關(guān)基因的檢測(cè)。結(jié)果表明,所有菌株都攜帶toxR和toxRS基因。28株臨床菌株

7、(28/32,87.5％)和3株海產(chǎn)品分離株(3/2261.32％)為tdh陽(yáng)性,3株臨床株(9.4％)和7株海產(chǎn)品分離株(3.09％)為trh基因陽(yáng)性。31 tdh-陽(yáng)性的臨床和海產(chǎn)品分離株中,30株(30/31,96.77％)為神奈川現(xiàn)象陽(yáng)性,而10株trh-陽(yáng)性中,7株(70％)為尿素酶陽(yáng)性。1株海產(chǎn)品分離株和22臨床分離株屬于新流行株O3:K6。比較新的O3:K6流行株、O1:KUT和O4:K68與老的O3:K6菌株toxRS序

8、列,發(fā)現(xiàn)在第576至1244.位堿基之間存在著6個(gè)堿基的突變。在32株臨床分離株中,有26株為GS-PCR陽(yáng)性,17株為orf8-PCR陽(yáng)性。而在海產(chǎn)品和環(huán)境分離株中,只有1株為GS-PCR.陽(yáng)性,5株為orf8-PCR陽(yáng)性。上述結(jié)果顯示副溶血弧菌新流行株O3:K6和其它具有致病性的類似血清型均存在于中國(guó)沿海地區(qū)。
　　 選取16株具有不同表型和基因型的副溶血弧菌代表性菌株進(jìn)行體內(nèi)外致病性研究。結(jié)果表明不同來(lái)源的菌株其致病性存在

9、著一定的差異。臨床菌株的產(chǎn)腸毒素能力顯著高于海產(chǎn)品分離株(P＜0.01,73.82％vs62.07),經(jīng)腹腔注射后臨床菌株的小鼠毒力顯著強(qiáng)于海產(chǎn)品分離株(P＜0.05),LD50分別為106.62位和107.13。另外,臨床菌株具有更高的體外培養(yǎng)細(xì)胞(HeLa和Caco-2)粘附能力和更強(qiáng)的細(xì)胞毒性(HeLa),但無(wú)顯著性差異。Tdh陽(yáng)性分離株與tdh陰性菌株相比能產(chǎn)生更高的腸毒素(P＜0.05,74.24％vs60.55％),對(duì)小鼠毒

10、力更強(qiáng),LD50分別為106.55和107.21,具有顯著性差異(P＜0.05)。另外,tdh陽(yáng)性分離株具有更高的細(xì)胞粘附能力和更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。體內(nèi)外毒力試驗(yàn)表明trh陽(yáng)性分離株的致病性位于tdh陽(yáng)性與tdh和trh陰性菌株之間。上述結(jié)果表明副溶血弧菌臨床分離株或tdh陽(yáng)性菌株的體內(nèi)外致病性高于海產(chǎn)品分離株或tdh陰性菌株。
　　 為進(jìn)一步探討tdh基因的染色體定位和結(jié)構(gòu)特征,選取15株tdh陽(yáng)性的副溶血弧菌代表菌株(12株臨床

11、株和3株海產(chǎn)品分離株)進(jìn)行tdh基因的克隆和序列分析。結(jié)果表明10株臨床株的tdh屬于tdh1(相似性＞98％),2株臨床株和1株海產(chǎn)品分離株的tdh為tdh2(相似性＞99.2％),另外2株海產(chǎn)品分離株的tdh則屬于tdh3(相似性＞98％)。此外,采用長(zhǎng)距離PCR(LA-PCR)對(duì)海產(chǎn)品分離株HZ3412 kb長(zhǎng)的tdh臨近區(qū)域(位于全基因組的VPA1312至VPAl327；)進(jìn)行克隆和序列分析。結(jié)果表明該區(qū)域位于染色體2中,含有兩

12、個(gè)主要毒力相關(guān)基因,VPA1321和VPA1327,分別編碼細(xì)胞殺傷因子(cytotoxic necrotising factor)和胞外酶T(exoenzyme T)。同時(shí)采用基因步移試劑盒擴(kuò)增菌株F22 tdh啟動(dòng)子區(qū)域及其3’區(qū)域(長(zhǎng)為5.6 kb,tdh包括基因),該菌株同時(shí)含有tdh和trh基因,且無(wú)法用LA-PCR進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。結(jié)果表明,在tdh的5’端含有2個(gè)開放閱讀框架,ORF1和ORF2為類似插入序列,與副溶血弧