高時(shí)空分辨拉曼及表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)及其在細(xì)胞-電化學(xué)體系中的應(yīng)用.pdf

1、光譜檢測(cè)對(duì)“更快（時(shí)間分辨率）、更高（空間分辨率）、更強(qiáng)（信號(hào)）”的追求從未停止。細(xì)胞和電化學(xué)表面由于其體系分子濃度低，分子環(huán)境復(fù)雜，一直是光譜檢測(cè)的最大挑戰(zhàn)體系之一。
　　細(xì)胞是一個(gè)動(dòng)態(tài)的非均質(zhì)系統(tǒng)，不斷與環(huán)境發(fā)生物質(zhì)和能量交換。細(xì)胞的基本生命活動(dòng)過(guò)程是一個(gè)時(shí)刻發(fā)生快速變化和具有顯著空間差異的過(guò)程，這一過(guò)程變化又是由構(gòu)成它們的生物活性分子如蛋白質(zhì)的構(gòu)象、分布、相互作用等動(dòng)態(tài)變化決定的。對(duì)于細(xì)胞生命活動(dòng)的認(rèn)識(shí)就是要建立在對(duì)細(xì)胞中這

2、些活性分子動(dòng)態(tài)變化認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)之上。這不僅要求檢測(cè)表征技術(shù)有足夠高的靈敏度達(dá)到單分子單細(xì)胞水平，而且要有更高的空間分辨和時(shí)間分辨，實(shí)現(xiàn)分子組成、結(jié)構(gòu)、分布變化的動(dòng)力學(xué)過(guò)程的探測(cè)。而電化學(xué)體系中主要研究對(duì)象是荷電界面，所有涉及電荷轉(zhuǎn)移、能量轉(zhuǎn)換和儲(chǔ)存、離子輸運(yùn)、氧化和還原反應(yīng)都在該界面發(fā)生，界面的物理和化學(xué)性質(zhì)將對(duì)整個(gè)電極過(guò)程起著至關(guān)重要的影響。該界面所關(guān)注的分子數(shù)僅有單層或者亞單層，需要能在動(dòng)態(tài)檢測(cè)界面分子結(jié)構(gòu)的同時(shí)實(shí)時(shí)獲得各物種在空間分

3、布的信息的高靈敏檢測(cè)技術(shù)，這對(duì)于理解電化學(xué)界面結(jié)構(gòu)和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)過(guò)程將具有重要的意義。
　　拉曼光譜可以提供精細(xì)分子指紋信息又不受到CO2和水的干擾，而且光穩(wěn)定性高，適合多組分檢測(cè)。激發(fā)光波長(zhǎng)可以從紫外到近紅外，具有高空間分辨率。非常適合細(xì)胞和電化學(xué)的研究。但常規(guī)拉曼光譜的檢測(cè)靈敏度非常低，大大制約了其在細(xì)胞和電化學(xué)體系的廣泛應(yīng)用。而表面增強(qiáng)拉曼光譜極大地改善了拉曼光譜固有的信號(hào)弱的缺點(diǎn)，已實(shí)現(xiàn)單分子層和亞單分層物種的檢測(cè)，

4、且不受到本體物質(zhì)的干擾。因此拉曼光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜可以廣泛應(yīng)用在細(xì)胞和電化學(xué)的研究中。
　　但拉曼和表面拉曼光譜在細(xì)胞及電化學(xué)體系應(yīng)用中還存在一系列科學(xué)問(wèn)題亟待解決。細(xì)胞生命過(guò)程的時(shí)間尺度從毫秒級(jí)到數(shù)百小時(shí)。因此如何在如此寬泛的時(shí)間尺度內(nèi)獲得可靠信號(hào)就成為重點(diǎn)。長(zhǎng)時(shí)間尺度的光譜檢測(cè)，必然會(huì)帶來(lái)由于細(xì)胞長(zhǎng)期暴露在非正常培養(yǎng)環(huán)境中而引起的細(xì)胞自身生理過(guò)程發(fā)生不可控改變的不利影響。因此就需要細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)環(huán)境進(jìn)行合理控制，使其在檢測(cè)

5、過(guò)程中不發(fā)生不可控的生理變化。短時(shí)間尺度，就需要靈敏度更高的光譜檢測(cè)手段才能在高時(shí)間分辨率的情況下同時(shí)保證光譜具有良好的信噪比。另一方面，在許多電化學(xué)體系中表面增強(qiáng)拉曼光譜還不能提供足夠的信號(hào)強(qiáng)度以開(kāi)展時(shí)空分辨的動(dòng)態(tài)研究，這在一定程度上制約了拉曼在電化學(xué)體系中的應(yīng)用范圍。目前檢測(cè)靈敏度低和成像速度慢仍然是制約多數(shù)細(xì)胞和電化學(xué)拉曼光譜及其表面增強(qiáng)拉曼光譜研究的重要因素。
　　本論文圍繞細(xì)胞和電化學(xué)這兩類重要體系，開(kāi)展拉曼與表面增強(qiáng)拉

6、曼光譜的高時(shí)空分辨檢測(cè)研究。發(fā)展原位細(xì)胞顯微培養(yǎng)裝置，對(duì)細(xì)胞開(kāi)展長(zhǎng)時(shí)間原位拉曼檢測(cè)和成像。建立暗場(chǎng)和SERS聯(lián)用技術(shù)，開(kāi)展對(duì)細(xì)胞內(nèi)吞納米粒子過(guò)程研究。建立動(dòng)態(tài)SERS檢測(cè)方案，提高弱吸附低濃度物質(zhì)的SERS檢測(cè)靈敏度和時(shí)間分辨率。建立電化學(xué)SERS顯微技術(shù)，提高電化學(xué)SERS檢測(cè)的時(shí)空分辨率，實(shí)現(xiàn)對(duì)電極表面過(guò)程的高時(shí)空分辨成像。本論文工作的創(chuàng)新點(diǎn)和主要成果如下:
　　1.為了解決在長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞拉曼光譜檢測(cè)過(guò)程中，檢測(cè)環(huán)境條件和細(xì)胞培

7、養(yǎng)環(huán)境條件存在差異這一問(wèn)題，我們搭建了適用于不同顯微和光譜系統(tǒng)的原位細(xì)胞顯微培養(yǎng)裝置。對(duì)干細(xì)胞骨分化過(guò)程，和饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激過(guò)程進(jìn)行了拉曼成像監(jiān)測(cè)。并發(fā)展了一系列數(shù)據(jù)分析方法，對(duì)細(xì)胞生命過(guò)程的拉曼光譜成像數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從中提煉相關(guān)的生物學(xué)信息。
　　2.為了研究納米粒子進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程中，納米粒子和細(xì)胞相互作用過(guò)程，我們搭建了暗場(chǎng)-SERS聯(lián)用系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行暗場(chǎng)和SERS同時(shí)觀察。發(fā)現(xiàn)一種新的納米粒子吞入細(xì)胞形式。對(duì)細(xì)胞內(nèi)吞納米粒

8、子過(guò)程進(jìn)行成像研究，利用統(tǒng)計(jì)分析方法，區(qū)別了納米粒子內(nèi)吞階段。
　　3.為了提高SERS技術(shù)對(duì)弱吸附低濃度物種的原位檢測(cè)靈敏度，我們建立了動(dòng)態(tài)SERS檢測(cè)技術(shù)，提高對(duì)弱吸附低濃度物種的SERS檢測(cè)靈敏度和時(shí)間分辨率。此外利用動(dòng)態(tài)SERS檢測(cè)技術(shù)，開(kāi)展了小概率分子事件的檢測(cè)以及吸附動(dòng)力學(xué)和分子結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)的研究。
　　4.為了提高電化學(xué)檢測(cè)的時(shí)空分辨率，我們擴(kuò)展動(dòng)態(tài)SERS檢測(cè)技術(shù)，建立了電化學(xué)表面增強(qiáng)拉曼顯微技術(shù)，通過(guò)SERS信