鼠傷寒沙門氏菌crp-cya缺失株的構(gòu)建及其免疫原性初步研究.pdf

1、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium，St)是一種腸道致病菌，其宿主廣泛，沒有特異性，可存在于多種家畜、家禽、飛禽、鼠類及其他小動物和人類的腸道中，有很強(qiáng)的致病性，可導(dǎo)致胃腸炎、發(fā)熱、副傷寒和腹瀉等疾病，嚴(yán)重威脅到養(yǎng)殖業(yè)。并且該菌可引起人類食物中毒和其他疾病，危害人類健康。因此，對該菌的控制和預(yù)防在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生學(xué)上均具有十分重要的意義?；谀退幮院褪称钒踩矫娴目紤]，接種疫苗是控制和預(yù)防鼠傷寒沙門氏菌病

2、的最佳選擇。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和對細(xì)菌遺傳學(xué)的研究不斷深入，通過基因工程方法制備鼠傷寒沙門氏菌疫苗取得了很大成就，已初步得到應(yīng)用并顯示出良好的前景。
　　本研究旨在研制更加安全有效的減毒鼠傷寒沙門氏菌基因缺失株，并為進(jìn)一步將其開發(fā)為弱毒苗特別是適于黏膜免疫的口服疫苗活載體奠定一定基礎(chǔ)。以編碼環(huán)化腺苷酸(cAMP)合成酶的 cya和編碼 cAMP受體蛋白的 crp基因作為鼠傷寒沙門氏菌 SL1344株的減毒基因，在本室已經(jīng)缺失 c

3、ya基因的基礎(chǔ)上進(jìn)一步缺失 crp基因，構(gòu)建鼠傷寒沙門氏菌 SL1344株 cya/crp雙基因缺失突變株，對比各菌株生物學(xué)特性并對雙缺失株的免疫原性進(jìn)行初步研究。主要內(nèi)容包括：
　　1.鼠傷寒沙門氏菌?crp?cyaSL1344缺失株的構(gòu)建及篩選
　　以含有重組自殺性質(zhì)粒 pRE?crp的大腸桿菌χ7213為供體菌，鼠傷寒沙門氏菌?cyaSL1344為受體菌，利用重組自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)細(xì)菌基因等位交換的作用，兩步法篩選出無抗性

4、的?crp?cyaSL1344雙基因缺失株，并通過 PCR及測序鑒定，確定構(gòu)建成功。
　　2.缺失株?crp?cyaSL1344與各菌株生物學(xué)特性的比較研究
　　對雙基因缺失株?crp?cyaSL1344的表型、遺傳穩(wěn)定性、生長特性以及對雛雞的致病力等生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，并系統(tǒng)的對比4種菌株的生物學(xué)特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙缺失株與野生株 SL1344相比，生化特性發(fā)生明顯變化，?crp?cyaSL1344失去了利用麥芽糖、甘露

5、醇、山梨醇等碳源的能力，也不能分解 H2S，但保留了利用葡萄糖的能力，這些都與親本株?cyaSL1344及?crpSL1344一致，但是對個別糖的分解利用能力卻有變化，不能分解半乳糖和鼠李糖；4種菌株的明膠液化試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、L-賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、枸緣酸鹽利用試驗(yàn)結(jié)果都一致，血清型也相同，均為1,4,5,12:i:1,2；雙缺失株?crp?cyaSL1344能夠穩(wěn)定遺傳缺失后的crp基因，毒力進(jìn)一步降低，

6、較野生株SL1344減毒至少106倍。
　　3.缺失株?crp?cyaSL1344對雛雞免疫原性初步觀察
　　以?crp?cyaSL1344口服免疫4日齡雛雞后，利用間接ELISA法檢測雛雞血清中 IgG抗體，觀察免疫雛雞 IgG抗體水平的動態(tài)變化，初步觀察雙缺失株?crp?cyaSL1344對雛雞的免疫原性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雛雞免疫后，同對照組相比較，免疫組血清抗體 IgG明顯高于對照組。免疫組雛雞的血清抗體 IgG含量呈逐漸上