大豆疫霉延胡索酸還原酶PsFRD基因克隆與功能分析.pdf

1、隨著全球大豆產(chǎn)量的增加，有關(guān)大豆疫霉引起的大豆疫病的報(bào)道也屢見不鮮。大豆疫霉（Phytophthora sojae）是大豆上的毀滅性病害，能導(dǎo)致大豆的減產(chǎn)，該病害最早于1948年在美國(guó)報(bào)道，并隨后迅速躍升為影響大豆生長(zhǎng)的重要病害之一。
　　延胡索酸還原酶(fumarate reductase;FRD）在較低等的真核生物和微氧或厭氧環(huán)境中生存生物的線粒體中扮演厭氧能量代謝的作用，其與線粒體中復(fù)合體Ⅱ黃素蛋白亞基中黃素腺嘌呤二核苷酸輔

2、基FAD結(jié)合，催化延胡索酸還原為琥珀酸，與琥珀酸脫氫酶的還原反應(yīng)互為逆反應(yīng)，是三羧酸循環(huán)和線粒體呼吸鏈的重要組成部分。
　　本學(xué)位論文主要開展大豆疫霉延胡索酸還原酶基因（Fumarate reductase，PsFRD）的功能及作用研究。對(duì)大豆疫霉延胡索酸還原酶基因PsFRD進(jìn)行克隆試圖揭示大豆疫霉PsFRD與大豆疫霉致病機(jī)制的關(guān)系，為新型高效的靶標(biāo)性生物農(nóng)藥研究提供理論依據(jù)。試驗(yàn)得出以下結(jié)論:
　　(1)利用報(bào)道的致病疫霉

3、FRD序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)，得到大豆疫霉的基因PsFRD序類。對(duì)PsFRD的氨基酸序列進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)構(gòu)結(jié)果顯示其含有一個(gè)FAD_binding_2保守結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，與寄生性水霉（Saprolegnia parasitica）等水霉屬，蝦瘟真菌（Aphanomyces astaci）等絲囊霉屬的PsFRD蛋白聚在一類，親緣關(guān)系最近。而相對(duì)于擬南芥（Arabidopsis thaliana）等陸生植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)

4、。ExPASy在線網(wǎng)站中蛋白預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，PsFRD是一種親水蛋白，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且不具跨膜結(jié)構(gòu)。
　　(2)利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)PsFRD在不同時(shí)期的表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)在游動(dòng)孢子和游動(dòng)孢子囊期PsFRD的表達(dá)量低于菌絲期和休止孢萌發(fā)期。在菌絲侵染24h后，PsFRD的表達(dá)量最高為1.58。
　　(3)成功構(gòu)建PsFRD-PTOR-GFP瞬時(shí)表達(dá)載體，獲得突變體5株。選取突變體中PsFRD表達(dá)量相對(duì)于p6497表達(dá)量的0.3和0.5倍

5、的N3，N5做后續(xù)試驗(yàn)。
　　(4)對(duì)沉默突變體N3，N6進(jìn)行抗逆境脅迫試驗(yàn)，在3nmol/L H2O2V8培養(yǎng)基上N3，N6菌株5d的菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度分為1.79cm和2.38cm是野生型WT4.49cm的39.87％和53％。在0.7mol/LNacl培養(yǎng)基上N3，N6菌株5d的菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度分為:1.83cm和2.12cm是野生型WT2.87cm的63.76％和73.87％。試驗(yàn)表明突變體相對(duì)于P6497的耐鹽性，耐活性氧的能力有