KSHV編碼vGPCR對斑馬魚胚胎早期發(fā)育的影響.pdf

1、卡波氏肉瘤(KS)是艾滋病患者常見的高致死性血管增生型腫瘤?？úㄊ先饬鱿嚓P(guān)皰疹病毒(KSHV)是KS的直接病因，該病毒基因組編碼的G-蛋白偶聯(lián)受體(vGPCR)是已知的幾個KSHV致瘤蛋白之一，此蛋白與KSHV相關(guān)惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。vGPCR在細(xì)胞中的表達(dá)能夠激活多條信號通路和影響諸多轉(zhuǎn)錄因子從而增加促炎癥細(xì)胞因子和血管生成細(xì)胞因子的生成。vGPCR在裸鼠中表達(dá)能夠引起裸鼠產(chǎn)生腫瘤，轉(zhuǎn)vGPCR基因小鼠也能形成類似人類KS的病變。

2、
　　斑馬魚是一種重要的模式生物，在胚胎發(fā)育機(jī)制的研究及各種人類疾病研究中得到了廣泛的應(yīng)用。斑馬魚作為人類病毒研究的模式生物罕見報道，目前尚未有采用斑馬魚來研究KHSV的研究報道。本研究首次采用斑馬魚來對KHSV中致癌基因vGPCR進(jìn)行研究，鑒定vGPCR對斑馬魚早期胚胎發(fā)育的影響。
　　本研究采用顯微注射法將vGPCR基因?qū)氚唏R魚受精卵;利用形態(tài)學(xué)觀察、mRNA水平表達(dá)檢測、血管生成定量分析和血管染色法分析vGPCR對斑

3、馬魚早期胚胎發(fā)育的影響。本論文研究內(nèi)容和研究結(jié)果如下:
　　1.以FRT/TO-cDNA5載體和CDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體為基礎(chǔ)構(gòu)建了表達(dá)vGPCR的重組質(zhì)粒CDH-CMV-HA-vGPCR-EF1-copGFP;
　　2.通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將CDH-CMV-HA-vGPCR-EF1-copGFP轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞，并進(jìn)行免疫印跡雜交檢測，結(jié)果顯示該重組質(zhì)粒能夠在細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)目的蛋白;
　　3

4、.采用顯微注射技術(shù)將CDH-CMV-HA-vGPCR-EF1-copGFP導(dǎo)入斑馬魚受精卵，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明注射vGPCR的實(shí)驗(yàn)組胚胎存活率為50.80％，GFP表達(dá)率為53.58％;注射空載體的對照組胚胎存活率為55.02％，GFP表達(dá)率為48.16％。形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果顯示，注射vGPCR的胚胎與對照組的發(fā)育進(jìn)程基本一致，vGPCR對斑馬魚胚胎早期形態(tài)發(fā)育未產(chǎn)生明顯影響;對注射了vGPCR并表達(dá)GFP的胚胎進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示vG

5、PCR在斑馬魚胚胎中存在較低水平的mRNA表達(dá);
　　4.利用堿性磷酸酶定量檢測法對vGPCR注射組斑馬魚胚胎和對照組胚胎分別進(jìn)行分析，結(jié)果表明兩組胚胎的堿性磷酸酶含量相差不大，表明vGPCR對斑馬魚早期胚胎血管生成總量無明顯影響;
　　5.對注射vGPCR后72小時的胚胎血管進(jìn)行堿性磷酸酶染色，觀察到斑馬魚胚胎新生血管發(fā)育受到了不同程度的影響，主要為腸下靜脈扭曲與血管排布紊亂，說明vGPCR能夠造成斑馬魚胚胎早期血管發(fā)育畸