HCV非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白在復(fù)制和感染中的作用.pdf

1、一、JFH1 NS5A基因置換對(duì)FL-J6JFH1復(fù)制和感染的影響 以我國HCV最主要基因型(1b型J4株)的NS5A替換FL-J6JFH的相應(yīng)基因得到嵌合型FL-J6JFH/J4NS5A，與野生型FL-J6JFH1，以及復(fù)制缺陷型陰性對(duì)照FL-J6JFH(GND)線性化后體外轉(zhuǎn)錄成RNA，用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染Huh-7.5.1細(xì)胞。比較三者轉(zhuǎn)染細(xì)胞在培養(yǎng)過程中HCV RNA水平差異。轉(zhuǎn)染后第5，8，12天抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成

2、cDNA后作為模板，以HCV特異的熒光定量PCR(FQ RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HCV的RNA水平。結(jié)果顯示，在檢測(cè)的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上嵌合體轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV RNA水平一直低于野生型轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在第5天，F(xiàn)L-J6JFH轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCVRNA為1.1×106 GE/gg RNA，第8天，下降到9.5x105GE/μtg RNA，此后RNA水平明顯上升，第12天上升到4.6×106 GE/μg RNA。而嵌合體FL-J6JFH/J4NS5A的

3、HCVRNA水平則維持在一個(gè)較低且穩(wěn)定的水平(104 GE/μg RNA以上)。陰性對(duì)照FL-J6JFH(GND)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后HCV RNA很快被宿主細(xì)胞清除。以丙型肝炎患者血清為一抗，免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV蛋白的表達(dá)，在第3、5、8和12天FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4NS5A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)都可以檢測(cè)到HCV蛋白表達(dá)，F(xiàn)L-J6JFH/J4NS5A轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光強(qiáng)度要顯著低于野生型FL-J6JFH轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而對(duì)照的FL-

4、J6JFH(GND)轉(zhuǎn)染則沒有檢測(cè)到HCV蛋白陽性細(xì)胞。上述結(jié)果表明，野生型FL-J6JFH和NS5A置換后的FL-J6JFH/J4NS5A都能在Huh7.5.1細(xì)胞中長(zhǎng)時(shí)間有效復(fù)制，F(xiàn)L-J6JFH/J4NS5A的復(fù)制能力較野生型有很大程度降低。收集FL-J6JFH/J4NS5A和FL-J6JFH轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清(d3、d5、d8、d12)，感染naive Huh-7.5.1細(xì)胞，72h后免疫熒光法檢測(cè)HCV蛋白陽性細(xì)胞，結(jié)果都可見HC

5、V蛋白的表達(dá)，但FL-J6JFH/J4NS5A的蛋白表達(dá)水平要顯著低于野生型FL-J6JFH。上述結(jié)果表明，F(xiàn)L-J6JFH和FL-J6JFH/J4NS5A轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，都能產(chǎn)生具有感染性的病毒顆粒(HCVcc)。不同的是，F(xiàn)L-J6JFH NS5A被置換后，病毒的復(fù)制、蛋白的翻譯以及感染性病毒顆粒的分泌都顯著降低，說明了JFH NS5A在FL-J6JFH體外高效復(fù)制中起重要作用。 二、NS5A定點(diǎn)突變對(duì)置換后HCV復(fù)制能力下降的

6、代償作用 采用人工定點(diǎn)突變的方法，將HCV NS5A的2197位上的絲氨酸突變成脯氨酸(Ser-Pro)，2201位上絲氨酸缺失(deletion)，和2204位上的絲氨酸突變成異亮氨酸(Ser-Ile)，構(gòu)建四個(gè)突變復(fù)制子，即FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P)、FL-J6JFH/J4NS5A(S2201del)、FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2201del)和FL-J6JFH/J4NS5A(S21

7、97P+S2204I)。將四個(gè)突變子和未突變的FL-J6JFH/J4NS5A體外轉(zhuǎn)錄后分別轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后第10天收集細(xì)胞進(jìn)行RNA和蛋白檢測(cè)。用HCV特異性引物進(jìn)行PCR定性檢測(cè)，在轉(zhuǎn)染后第10天所有的復(fù)制子都檢測(cè)到了特異性大小的HCV條帶。以Semi-FQ RT-PCR比較突變前后復(fù)制子轉(zhuǎn)染細(xì)胞在培養(yǎng)過程中HCVRNA表達(dá)水平的差異。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后FL-J6JFH/J4NS5A(S2201del)和FL-J6JFH

8、/J4NS5A(S2197P+S2204I)的HCV RNA水平都有顯著的升高，最高的為FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I)，為突變前的FL-J6JFH/J4NS5A RNA水平的800％，而FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P)和FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2201del)的RNA水平則有所降低，但幅度不大，均保持在突變前FL-J6JFH/J4NS5A RNA水平的85％以上。轉(zhuǎn)染后

9、第5和第8天收集細(xì)胞，熒光定量PCR檢測(cè)突變前后復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCVRNA的水平。FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I)和FL-J6JFH/J4NS5A(S2201del)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)RNA水平相較突變前有了提高。RNA水平最高組為FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I)，第8天細(xì)胞內(nèi)RNA水平為5.3×105GE/ug RNA，為突變前FL-J6JFH/J4NS5A第8天細(xì)胞內(nèi)RNA水平

10、的約120倍(4.2x104GE/ug RNA)。FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P)和FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2201del)與突變前相比，細(xì)胞內(nèi)RNA水平有所下降，其中最低為FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2201del)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后第8天，為3.3×103GE/ug RNA，約為RNA水平最高組的1/160。免疫熒光染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV NS5A蛋白的表達(dá)情況，與突變前FL-J

11、6JFH/J4NS5A相比，突變后的FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P)和FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+2201del)的HCV陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，最少的為FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+2201del)，在轉(zhuǎn)染后第5天和第10天，幾乎不可見陽性細(xì)胞。 三、Core區(qū)基因能置換對(duì)FL-J6JFH病毒復(fù)制影響的研究 采用基因置換的方法(Gene swapping)，用我國HCV感染最

12、常見的基因型(1b型J4株)的core區(qū)基因替換了FL-J6JFH的相應(yīng)基因，構(gòu)建基因型間嵌合體FL-J6JFH/J4core。將FL-J6JFH1、FL-J6JFH/J4NS5A和FL-J6JFH/J4core用Xball線性化后，體外轉(zhuǎn)錄成RNA，用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后第5天用FQ RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV RNA水平。結(jié)果表明，F(xiàn)L-J6JFH/J4core的RNA水平約為5.6

13、×105GE/ug RNA，與野生型FL-J6JFH1相當(dāng)，而FL-J6JFH/J4NS5A轉(zhuǎn)染后第5天細(xì)胞內(nèi)RNA水平僅為4.3×104GE/ug RNA。轉(zhuǎn)染后第8天，免疫熒光檢測(cè)HCV陽性細(xì)胞，野生型FL-J6JFH1的陽性細(xì)胞數(shù)在細(xì)胞總數(shù)中的比例達(dá)到了50％，而FL-J6JFH/J4core的值約為30％多，低于core置換前的野生型FL-J6JFH1株的水平。RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞第8天陽性細(xì)胞數(shù)比例最少的是FL-J6JFH/J4N

14、S5A，不足5％左右，提示結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物之間的相互作用，會(huì)影響HCV的復(fù)制水平。與對(duì)照FL-J6JFH1相比，F(xiàn)L-J6JFH/J4core的陽性細(xì)胞數(shù)有了一定程度上的減少。 四、包膜區(qū)替換對(duì)HCV細(xì)胞親嗜性影響的研究 生長(zhǎng)致密的單層BHK-21細(xì)胞按0.001MOI接種乙型腦炎病毒(JEV)疫苗株SAl4-14-2，培養(yǎng)72h左右至細(xì)胞發(fā)生明顯的病變效應(yīng)(CPE)，用JEV E單抗免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果陽性細(xì)胞數(shù)

15、占總細(xì)胞數(shù)的接近70％。收集感染細(xì)胞的上清，抽提RNA后，用RT-PCR的方法，擴(kuò)增出包含JEV prM和E區(qū)基因的片段。再用重疊延伸PCR、酶切連接等方法，平行替換同屬黃熱病毒HCV2a型FL-J6JFH的E區(qū)，構(gòu)建了HCV/JEV嵌合復(fù)制子。HCV/JEV嵌合子體外轉(zhuǎn)錄，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，免疫熒光檢測(cè)證實(shí)嵌合病毒HCV/JEV能在BHK-21細(xì)胞中表達(dá)蛋白，RT-PCR檢測(cè)證實(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有病毒RNA的復(fù)制。嵌合病毒的蛋白

16、表達(dá)和RNA復(fù)制水平明顯低于J6JFH1病毒。 小結(jié)： 1．與野生型FL-J6JFH相比，F(xiàn)L-J6JFH/J4NS5A的復(fù)制能力顯著降低，表明NS5A是影響HCV復(fù)制的重要因子。FL-J6JFH/J4NS5A轉(zhuǎn)染細(xì)胞后不發(fā)生細(xì)胞病變效應(yīng)，可能更加接近天然存在的HCV，可以作為進(jìn)一步研究影響HCV NS5A的關(guān)鍵決定因子的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。 2．采用人工定點(diǎn)突變的方法，構(gòu)建HCV NS5A上氨基酸替換或缺失的四個(gè)突變復(fù)制

17、子，即FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P)、FL-J6JFH/J4NS5A(S2201del)、FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2201del)和FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I)。比較4個(gè)突變子與FL-J6JFH/J4NS5A在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制水平的差異，發(fā)現(xiàn)了高復(fù)制能力的FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I)，說明關(guān)鍵氨基酸的替換能夠有效對(duì)NS5A置換后復(fù)制能力的下

18、降起到一定的代償作用。 3．用J4 core平行替換野生型的FL-J6JFHl，得到了FL-J6JFHH4core復(fù)制子，并對(duì)其在Huh7.5.1細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、翻譯水平以及產(chǎn)生感染性病毒顆粒能力的改變進(jìn)行了探討。 4．用同屬黃熱病毒的乙型腦炎病毒的prM和E區(qū)(決定細(xì)胞親嗜性)，平行替換HCV2a型FL-J6JFH1的E基因，構(gòu)建了嵌合的HCV/JEV復(fù)制子，并對(duì)其在BHK-21細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，為建立HC