新株型水稻潛在姜烯合成酶基因的克隆、表達和序列分析.pdf

1、萜烯類化合物作為植物次生代謝產(chǎn)物中最大的一個家族，在自然界中廣泛分布。在植物、植食性昆蟲及天敵三者之間扮演著“信使”角色，能夠引起昆蟲行為和生理上的多種反應(yīng)，是對昆蟲行為產(chǎn)生調(diào)控作用的一種重要因素。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，對高等植物體內(nèi)萜烯類化合物的次生代謝合成途徑及其相關(guān)合酶的研究日趨增多，多種生物體內(nèi)大量萜類合酶被克隆并功能分析。本研究在利用頂空固相微萃取一氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了水稻揮發(fā)性化學成分的基礎(chǔ)上，根據(jù)KOME數(shù)據(jù)庫中

2、的水稻cDNA信息設(shè)計引物，以水稻葉片cDNA為模板，經(jīng)PCR獲得兩條萜烯合酶基因全長序列，并將克隆得到的基因在大腸桿菌BL21菌株中進行異源表達。另外從生物信息學角度，對所得基因的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征、疏/親水性、二級結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細胞定位、功能域和系統(tǒng)發(fā)育等方面進行了分析，為后續(xù)實驗提供理論參考。目前取得以下一些初步結(jié)果，(1)利用Hs-SPME-GC-MS技術(shù)，通過檢索NIST質(zhì)譜庫，運用色譜峰面積歸一化

3、法對四個品種水稻IR68011、TZRO、SN89366和汕優(yōu)63的揮發(fā)性化學成分及相對含量的分析結(jié)果表明，其主要揮發(fā)性成分為直鏈烷烴類化合物(17種)和倍半萜烯類化合物(5種)，另外還有少量酯類(2種)、醇類(1種)和酮類(1種)。其中TZRO揮發(fā)物中的倍半萜烯類化合物的含量最為豐富，含有β-倍半水芹烯(3.25％)、α-姜烯(3.01％)、α-香檸檬烯(1.7％)、α-姜黃烯(1.57％)、β-紅沒藥烯(1.48％)，而IR6801

4、1含有其中的α-姜烯(6.82％)和α-姜黃烯(2.4％)兩種倍半萜烯，不過IR68011中的姜烯含量是TZRO中的兩倍之多。本研究沒有在水稻揮發(fā)物中檢測到單萜烯化合物。 (2)對KOME數(shù)據(jù)庫中水稻的cDNA信息進行BLAST搜索，并設(shè)計引物，抽提富含姜烯的水稻品系IR68011葉片的總RNA，通過RT-PCR擴增得到兩條潛在姜烯合酶基因序列ZISl和ZIS2，測序結(jié)果顯示其ORF分別為1800 bp和1515 bp，利用基因

5、融合表達系統(tǒng)將得到的基因在大腸桿菌BL21菌株中進行表達，并摸索優(yōu)化了原核表達條件，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，目的基因獲得了大量表達，不過絕大多數(shù)原核表達蛋白均以無活性的包涵體形式存在，對后續(xù)的蛋白種類鑒定和活性測定帶來了一定困難。 (3)生物信息學分析表明，ZISl和ZIS2有著極為相似的堿基組成比例，ZISl的A:G:T:C=30:22.78:26.56:20.67，ZIS2的A:G:T:C=30.89:22.84:27

6、.13:19:14，兩者中A+T的含量均相對較多。ZISl編碼599 aa，ZIS2編碼504 aa，同樣ZISl和ZIS2也有著相似的氨基酸組成比例，含量最為豐富的氨基酸為Leu，分別為10.18％和10.91％。 經(jīng)分析，ZISl和ZIS2均為親水性蛋白，均無導肽序列和信號肽序列，由導肽和信號肽的分析結(jié)果可推斷，其對應(yīng)的蛋白在細胞質(zhì)中合成后，不進行轉(zhuǎn)運，而是留在細胞質(zhì)基質(zhì)中，直接與代謝底物作用?？缒^(qū)域分析結(jié)果顯示．ZISl

7、和ZIS2均不含跨膜區(qū)，這也對導肽和信號肽的推測結(jié)果進行了驗證，即二者在細胞質(zhì)中合成后，不進行跨膜轉(zhuǎn)運，直接在細胞質(zhì)基質(zhì)中的特定部位發(fā)揮作用。氨基酸序列功能位點搜索結(jié)果顯示，ZISl含有3個N-糖基化位點，1個環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥苷相關(guān)的蛋白激酶磷酸化位點，7個蛋白激酶C磷酸化位點，8個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，1個酪氨酸激酶磷酸化位點，4個N-肉豆蔻?；稽c，1個酰氨化位點；ZIS2含有1個N-糖基化位點，4個蛋白激酶C磷酸化位點，7個

8、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，2個酪氨酸激酶磷酸化位點，2個N-肉豆蔻酰化位點，1個細胞附著位點。這些序列中功能位點的多樣性很好的說明了萜烯合酶功能的多樣性。對ZISl和ZIS2氨基酸序列的結(jié)構(gòu)功能域分析，發(fā)現(xiàn)了兩個功能域，一個是N-terminal domain(PF01397)，該功能域?qū)儆谳葡┖厦讣易?TPS)所有，另一個為萜烯合酶結(jié)合金屬離子的功能域(PF03936)。氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，α-螺旋和不規(guī)則卷曲是最大量的結(jié)

9、構(gòu)元件，在ZISl中分別占59.93％和28.21％，在ZIS2中分別占72.82％和18.65％，另外均有少量的β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈。 從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載了54條不同植物多種萜烯合酶的基因序列，對其進行序列比對，并進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示ZISl和．ZIS2均含有萜烯合酶共有保守區(qū)DDXXD序列，并與單子葉植物水稻和玉米的倍半萜烯合酶的關(guān)系最為接近，同時結(jié)果也顯示，除個別序列外，總體上單萜烯合酶、倍半萜烯合酶和二萜烯合