心鈉素在原代培養(yǎng)大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的：觀察心鈉素（atrial natriuretic peptide，ANP）在原代培養(yǎng)大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞（spiral ganglion neurons，SGN）中是否表達(dá)，并探討其意義。
　　方法：1.對(duì)3～5日的新生SD大鼠耳蝸SGN進(jìn)行原代培養(yǎng)以及純化，倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法（免疫酶標(biāo)以及免疫熒光法）檢測(cè)原代培養(yǎng)SGN中神經(jīng)元特異性核蛋白（neuron-specific nuclear

2、protein，NeuN）表達(dá)情況，進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞的神經(jīng)源性鑒定。
　　2.應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)原代培養(yǎng)的SGN中ANP的表達(dá)情況，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）方法檢測(cè)原代培養(yǎng)的SGN中是否存在編碼ANP的mRNA。
　　結(jié)果：1.SGN的原代培養(yǎng)：細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)24h后，多數(shù)SGN呈雙極神經(jīng)元特征形態(tài)，胞體兩極伸

3、出突起，可達(dá)胞體的2～5倍，并附著在成纖維細(xì)胞形成的單層細(xì)胞層表面生長(zhǎng)；有的呈三極神經(jīng)元形態(tài)，神經(jīng)突向三個(gè)方向伸展。48～72h后，可見細(xì)胞突起交織成網(wǎng)狀的細(xì)胞群，個(gè)別細(xì)胞突起可達(dá)胞體的7～8倍。還可見扁平多角形大胞體的成纖維細(xì)胞，以及長(zhǎng)梭形雙極的雪旺細(xì)胞（schwann cells）等非神經(jīng)細(xì)胞。
　　2.SGN的免疫細(xì)胞化學(xué)：可見NeuN在SGN胞體和突起中具有陽性表達(dá)，而扁平多角形的成纖維細(xì)胞與長(zhǎng)梭狀雪旺細(xì)胞NeuN染色陰性

4、；SGN的胞質(zhì)中含有大量棕黃色ANP免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)，為分散或成團(tuán)的顆粒。免疫熒光染色顯示原代培養(yǎng)SGN中NeuN、ANP、Hoechst熒光信號(hào)的共表達(dá)：紅色熒光顯示NeuN在橢圓形胞體和神經(jīng)突起著色；綠色熒光顯示ANP主要在細(xì)胞胞體和突起中著色，在近胞核周圍的胞質(zhì)中分布尤為密集；藍(lán)色熒光為Hoechst襯染胞核。
　　3.ANP-mRNA在原代培養(yǎng)SGN細(xì)胞中的表達(dá)：培養(yǎng)5日SGN提取的RNA用RT-PCR方法擴(kuò)增出編碼ANP