Mfn2基因調(diào)節(jié)泡沫細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分:Mfn2基因表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成
　　目的：
　　通過(guò)比較C57/BL小鼠與apoE基因敲除小鼠主動(dòng)脈斑塊組織中Mfn2蛋白表達(dá)水平差異；比較動(dòng)脈粥樣硬化和非動(dòng)脈粥樣硬化的人主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈中Mfn2蛋白表達(dá)水平差異，探討Mfn2蛋白表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化形成的相關(guān)性。
　　方法：
　　通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)apoE基因敲除小鼠建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。apoE基因敲

2、除小鼠和C57/BL小鼠麻醉后心臟取血處死，取主動(dòng)脈組織行油紅O染色觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，圖像軟件分析油紅染色陽(yáng)性面積，免疫熒光染色分析Mfn2蛋白表達(dá)，western blot分析血管組織中Mfn2蛋白表達(dá)水平。
　　分別取非心源性原因死亡患者和因冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者冠狀動(dòng)脈和主動(dòng)脈組織，免疫熒光染色分析Mfn2蛋白表達(dá)，western blot分析血管組織中Mfn2蛋白表達(dá)水平，實(shí)時(shí)定量PCR分析血管組織中Mfn2 m

3、RNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　與C57/BL小鼠相比，apoE基因敲除小鼠主動(dòng)脈斑塊組織中Mfn2蛋白表達(dá)水平明顯減少；與無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化的人主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈相比，CD68陽(yáng)性巨噬細(xì)胞增多的冠心病患者冠狀動(dòng)脈和主動(dòng)脈粥樣斑塊組織中，Mfn2蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯減少。
　　結(jié)論：
　　與健康小鼠主動(dòng)脈組織相比，動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的斑塊組織中Mfn2低表達(dá)；與無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化的人主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈相比，冠心病患者血

4、管的斑塊組織中Mfn2低表達(dá)，證實(shí)Mfn2蛋白表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成負(fù)相關(guān)，其可能與巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成有關(guān)。
　　第二部分:Mfn2基因?qū)ε菽?xì)胞脂質(zhì)沉積的影響及其機(jī)制研究
　　目的：
　　研究攜帶Mfn2基因的腺病毒（adv-Mfn2）干預(yù)對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響，及其對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響及其機(jī)制，探討Mfn2基因抗泡沫細(xì)胞形成的分子機(jī)制。
　　方法：
　　氧化低密度脂蛋白（oxLDL）誘導(dǎo)巨噬

5、細(xì)胞構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型，不同滴度adv-Mfn2感染巨噬細(xì)胞24和48小時(shí)后，通過(guò)油紅染色觀察泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的形態(tài)學(xué)改變，通過(guò)膽固醇檢測(cè)試劑盒分析細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯含量。以adv-lacZ為對(duì)照，觀察不同滴度adv-Mfn2對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的影響；與羅格列酮或GW9662共刺激下，Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及mRNA表達(dá)變化；進(jìn)一步應(yīng)用

6、PD98059或SB203580干預(yù)泡沫細(xì)胞后，Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PPARγ磷酸化水平及膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)子ABCA1和SR-BI mRNA水平變化。
　　結(jié)果：
　　過(guò)表達(dá)Mfn2降低巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積和細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量及膽固醇酯/總膽固醇比值，而adv-siRNA逆轉(zhuǎn)此作用；與adv-lacZ相比，adv-Mfn2促進(jìn)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）及其下游的膽

7、固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA1、ABCG1和SR-BI的表達(dá)，而減少膽固醇攝入受體CD36的表達(dá)。羅格列酮和GW9662分別促進(jìn)和抑制Mfn2基因過(guò)表達(dá)對(duì)膽固醇外排蛋白ABCA1、ABCG1和SR-BI的表達(dá)；應(yīng)用PD98059或 SB203580干預(yù)泡沫細(xì)胞后，部分抵消adv-siRNA對(duì)PPARγ磷酸化的促進(jìn)作用及對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA的降低作用。
　　結(jié)論：
　　Mfn2過(guò)表達(dá)，通過(guò)抑制MAPK通路磷酸化，促進(jìn)PPARγ蛋白