mPGES-1抑制劑MK886對白血病細(xì)胞增殖及耐藥性的影響.pdf

1、目的:急性白血病(acuteleukemia，AL)是常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一。目前化療在AL的治療中仍有不可替代的地位，但部分AL患者通過化療始終不能完全緩解(completeremission，CR)或CR后復(fù)發(fā)。為了提高白血病的治愈率，延長白血病患者的無病生存期，需要積極尋找新的治療靶點或化療增敏劑。 膜結(jié)合型前列腺素E2合酶1(membrane—boundprostaglandinE2synthase1，mPGES-1

2、)，是靶向合成前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)的特異性終末酶，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)mPGES-1在正常組織中表達(dá)很低或不表達(dá)，但在多種實體腫瘤如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、胃癌和乳腺癌中的表達(dá)水平明顯升高，抑制mPEGS-1的表達(dá)可顯著抑制腫瘤的生長。mPEGS-1可能作為腫瘤治療的一個新的靶基因，已引起腫瘤研究者的關(guān)注。 mPEGS-1對腫瘤細(xì)胞抑制作用的機(jī)制未明，有研究認(rèn)為可能與調(diào)控PG

3、E2的生物合成有關(guān)。PGE2屬于前列腺素類化合物(prostanoid，PGs)，可通過與G蛋白耦聯(lián)受體EP1、EP2、EP3和EP4結(jié)合，調(diào)控包括磷酸肌醇—3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(phosphoinositide3kinese/serine—threoninekinase，PI3K/AKT)通路在內(nèi)的多條信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和刺激血管生成等作用促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而抑制PGE2的合成可達(dá)到抗腫瘤效果。PGE2的生物合

4、成受磷脂酶A2(phospholipaseA2，PLA2)、環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)和mPEGS-1三種酶的順序調(diào)控，抑制上述三種酶的表達(dá)均可抑制PGE2的合成。 已有研究表明，白血病細(xì)胞COX—2表達(dá)水平增高，特異性COX—2抑制劑可抑制白血病細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)白血病細(xì)胞對化療藥物的敏感性。但COX—2抑制劑可以引起腎臟損害，增加心血管疾病發(fā)病和導(dǎo)致血栓形成的危險，而且抑制COX—2活性在削減

5、PGE2生成量的同時也使得具有抗癌作用的PGI2.PGD2的合成受抑，從而消弱其抗腫瘤效應(yīng)，因此其臨床應(yīng)用前景受到很大的限制。從理論上來講，直接抑制靶向PGE2合成的酶系mPEGS-1在減少副作用方面可能更具優(yōu)勢。迄今為止，關(guān)于mPGES-1與白血病的關(guān)系國內(nèi)外均未見有文獻(xiàn)報道。 本研究在證實白血病HL—60、HL—60/A細(xì)胞株高表達(dá)mPGES-1的基礎(chǔ)上，采用細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞術(shù)及westernblot、實時多聚酶鏈反應(yīng)(r

6、eal—timepolymerasechainreaction，real—timePCR)等多種細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，檢測mPGES-1抑制劑MK886作用后細(xì)胞mPGES-1、COX—2mRNA和蛋白的表達(dá)情況，觀察MK886對HL—60、HL—60/A細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞耐藥的影響，并檢測AKT信號通路的相關(guān)蛋白的變化，探討其發(fā)生機(jī)制，為mPGES-1抑制劑作用于白血病提供有價值的實驗依據(jù)，為白血病的治療拓展新的思路和方法。 本研

7、究采用的統(tǒng)計學(xué)方法：計量資料的描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，多組資料間的比較采用單因素方差分析。應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件作統(tǒng)計學(xué)處理。檢驗水準(zhǔn)定為P≤0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 本研究共分三部分進(jìn)行論述。 第一部分mPGES-1、COX—2在白血病HL—60和HL—60/A細(xì)胞的表達(dá)及意義 目的：觀察HL—60和HL—60/A細(xì)胞mPGES-1、COX—2及多藥耐藥基因mdr-1的表達(dá)，探討mPGES-1、

8、COX—2在白血病中的作用及與耐藥的關(guān)系。 方法：采用real—timePCR法對人急性髓系白血病敏感細(xì)胞株HL—60及耐阿霉素(adriamycin，ADM)的耐藥細(xì)胞株HL—60/A的mPGES-1、COX—2及多藥耐藥基因mdr-1mRNA進(jìn)行檢測，用westernblot法檢測HL—60、HL—60/A細(xì)胞mPGES-1、COX—2蛋白，流式細(xì)胞術(shù)檢測mdr-1基因編碼多藥耐藥蛋白P170的表達(dá)，與正常單個核細(xì)胞(mon

9、onuclearcell，MNC)進(jìn)行比較。 結(jié)論： (1)正常MNC低表達(dá)mPGES-1、COX—2，白血病HL—60、HL—60/A細(xì)胞高表達(dá)mPGES-1、COX—2，mPGES-1可成為白血病治療的新的作用靶點。 (2)耐藥細(xì)胞株HL—60/A中mPGES-1的表達(dá)高于敏感細(xì)胞株HL—60，mPGES-1可能成為逆轉(zhuǎn)白血病耐藥的一個潛在的分子靶點。 第二部分mPGES-1抑制劑MK886對HL—6

10、0和HL—60/A細(xì)胞增殖、凋亡的影響 目的：觀察mPGES-1抑制劑MK886作用后HL—60、HL—60/A細(xì)胞mPGES-1、COX—2表達(dá)和PGE2合成的變化以及MK886對HL—60、HL—60/A細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，并進(jìn)一步檢測PI3K/AKT通路中AKT、磷酸化AKT(phosphorylatedAKT，P—AKT)、Bcl—2、Bax表達(dá)、caspase—3活性及c—myc表達(dá)的變化，探討抑制mPG

11、ES-1表達(dá)對白血病細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。 方法：(1)提取經(jīng)不同濃度MK886作用48h后HL—60和HL—60/A細(xì)胞的RNA和蛋白，分別用real—timePCR法及westernblot方法檢測mPGES-1、COX—2mRNA和蛋白的表達(dá)情況。(2)收集經(jīng)不同濃度MK886作用48h后HL—60和HL—60/A的細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA法檢測上清液中PGE2的含量。(3)倒置顯微鏡下觀察經(jīng)不同濃度的MK886作用

12、不同時間后HL—60和HL—60/A細(xì)胞形態(tài)的變化，并采用CCK—8(CellCountingKit—8)法檢測細(xì)胞存活率。(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測經(jīng)不同濃度MK886作用48h后HL—60和HL—60/A細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布，熒光顯微鏡下觀察經(jīng)Hoechst33258染色的凋亡細(xì)胞。(5)提取經(jīng)不同濃度MK886作用48h后HL—60和HL—60/A細(xì)胞的蛋白，westernblot方法檢測AKT、P—AKT、Bax、Bcl—2、c—

13、myc蛋白表達(dá)的變化。(6)比色法檢測MK886作用后HL—60和HL—60/A細(xì)胞的caspase—3活性。 結(jié)論： (1)mPGES-1抑制劑MK886可劑量依賴性的下調(diào)HL—60、HL—60/A細(xì)胞mPGES-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，抑制PGE2的合成，對COX—2的表達(dá)無影響。 (2)MK886可抑制HL—60、HL—60/A細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與抑制PGE2的合成，進(jìn)而調(diào)控AKT通路及其

14、下游的Bcl—2家族和caspase—3活性有關(guān)。 (3)MK886可阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，細(xì)胞周期的停滯與MK886抑制PGE2合成，抑制AKT活性及下調(diào)c—myc表達(dá)有關(guān)。 第三部分MK886對HL—60/A細(xì)胞耐藥性的影響 目的：觀察MK886能否增強(qiáng)HL—60/A細(xì)胞的化療敏感性，檢測不同濃度的MK886對HL—60/A細(xì)胞mdr-1mRNA以及P170蛋白表達(dá)的影響，并結(jié)合前兩部分實驗結(jié)果，探討M

15、K886改變細(xì)胞化療敏感性的可能作用機(jī)制。 方法：(1)CCK—8法檢測HL—60、HL—60/A細(xì)胞對阿霉素(adriamycin，ADM)、柔紅霉素(dauhorubicin，DNR)、阿糖胞苷(cytrarabine，Ara—C)、依托泊苷(etoposide，VP-16)等四種化療藥物的敏感性及10 μmol/L MK886(此濃度的MK886對HL—60/A細(xì)胞無明顯毒性作用)作用48h后HL—60/A細(xì)胞對化療藥物敏

16、感性的變化，觀察MK886對HL—60/A細(xì)胞的耐藥性有無影響。(2)采用real—time PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測經(jīng)不同濃度MK886作用48h后HL—60/A細(xì)胞mdr1基因及P170蛋白的表達(dá)。 結(jié)論： (1)白血病HL—60、HL—60/A細(xì)胞高表達(dá)mPGES-1及COX—2，mPGES-1抑制劑MK886可劑量依賴性下調(diào)mPGES-1mRNA和蛋白的表達(dá)，抑制PGE2的合成，對COX—2的表達(dá)則無影響。

17、 (2)MK886可抑制HL—60、HL—60/A細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，作用機(jī)制與MK886抑制PGE2的合成，調(diào)控AKT通路及其下游的Bcl—2家族，下調(diào)c—myc表達(dá)和caspase—3活性有關(guān)。mPGES-1可能成為白血病治療的新靶點。 (3)耐藥細(xì)胞株HL—60/A中mPGES-1的表達(dá)高于敏感細(xì)胞株HL—60，MK886可通過抑制PGE2的合成，下調(diào)P170表達(dá)和誘導(dǎo)凋亡等作用增強(qiáng)HL—6