小鼠嗜酸性細胞CCR3基因RNA干擾慢病毒載體的構建及鑒定.pdf

1、目的：
　　 掌握小鼠嗜酸性細胞CCR3基因RNA干擾慢病毒載體的構建方法，通過慢病毒載體的構建，降低CCR3基因在嗜酸性細胞中的表達，從而為探討阻斷Eotaxin/CCR3路徑對嗜酸性細胞凋亡及其在骨髓、外周血及局部組織的募集、遷移及成熟過程的機制變化影響創(chuàng)造條件。
　　 方法：
　　 利用公用網(wǎng)站按照RNAi序列設計原則，設計RNAi靶點序列并合成靶序列的Oligo DNA，退火形成雙鏈DNA，與經 MluⅠ

2、、SacⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ和XhoⅠ進行酶切后的pLVX-shRNA2-m載體連接產生shRNA慢病毒載體。應用shRNA慢病毒載體轉染293T細胞及嗜酸性細胞細胞，測定病毒滴度，Q-PCR鑒定CCR3基因在嗜酸性細胞中的下調作用。
　　 結果：
　　 成功構建了shRNA-mCCR3慢病毒載體，經測序與設計合成的靶向鏈完全一致。熒光顯微鏡下觀察293T細胞感染效率大于90％，病毒滴度為4X108TU