TMP3在斑馬魚胚胎心臟發(fā)育中的初步功能研究.pdf

1、心臟是脊椎動物在其發(fā)育過程中最早形成和最先具有功能的器官，其發(fā)育過程受到多種基因的表達調(diào)控。這些基因的表達異常會導致各種心臟缺陷。先天性心血管病是先天性畸形中最常見的一類，我國每年出生嬰兒患各種先天性心臟病約有15萬，其中30％左右可能在嬰兒期死亡。因此，研究心臟發(fā)育的調(diào)控基因，有助于更好地了解心臟病的發(fā)病機制以及對該類疾病的治療。斑馬魚作為一種理想的模式動物，具有個體小、易于飼養(yǎng)、發(fā)育快、繁殖能力強且胚胎透明等優(yōu)點。更重要的是，斑馬魚

2、在解剖學上和生理學上與其它脊椎動物有很多相同的特征，因此使用斑馬魚研究脊椎動物的發(fā)育與遺傳具有極大的優(yōu)勢。
　　本研究室的前期研究顯示，斑馬魚基因TMP3可能參與胚胎時期心臟形態(tài)的發(fā)生，與ATF4蛋白相互作用，通過作用于靶基因Gata4調(diào)控心臟發(fā)育。本論文以斑馬魚為模型繼續(xù)研究TMP3基因在脊椎動物心臟發(fā)育中的功能。
　　本論文分為兩個階段研究，在第一階段，通過抗體染色分析TMP3蛋白在斑馬魚胚胎心臟發(fā)育中的表達，實驗結(jié)果顯

3、示TMP3蛋白在40％和50％外包時期主要在細胞核中表達，而72hpf階段主要在細胞膜上表達，且與ATF4蛋白相互作用。為了探究TMP3在斑馬魚發(fā)育中的作用，我們設(shè)計了反義Morpholinos寡核苷酸特異性敲低TMP3的表達，TMP3突變體表現(xiàn)出體長變短、尾巴卷曲;在48hpf可觀察到明顯的心臟畸形，包括環(huán)化不完全、線性化、房室管擴展、心動變緩和血液循環(huán)減少。ATF4突變體的表型與TMP3突變體的相似，TMP3/ATF4雙突變體的表型

4、更加嚴重，表明TMP3和ATF4可能通過相互作用共同調(diào)節(jié)斑馬魚心臟的正常發(fā)育。而共注射Gata4 mRNA能夠拯救單敲低TMP3或ATF4以及雙敲低TMP3和ATF4導致的心臟表型，說明Gata4和TMP3可能在同一條信號途徑上調(diào)控斑馬魚心臟的發(fā)育。本實驗室后續(xù)通過原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)，敲低TMP3會導致Gata4表達下調(diào)，表明GATA4可能在TMP3的下游。另外，熒光免疫實驗證明了敲低TMP3會導致trpomyosin（原肌球蛋白）的表達

5、下降，預示TMP3與心肌收縮性相關(guān)。在第二階段，本文對pTol2(cmlc2: TMP3-IRES-EGFP)過表達品系和TMP3敲除系進行表型分析，發(fā)現(xiàn)過表達TMP3會導致心臟心室變小、心房變大、環(huán)化異常等缺陷表型，而敲除TMP3會導致心臟心室變小、房室管擴展、環(huán)化異常等缺陷表型。利用M-Mode心臟生理學分析技術(shù)，進一步證明TMP3基因?qū)π呐K生理學功能起著重要的調(diào)控作用。心臟Edu檢測和TUNEL檢測的結(jié)果表明，TMP3調(diào)控心臟細胞