黃芪甲苷對高脂加鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的降血糖作用及其作用機(jī)制.pdf

1、糖尿病是一種由遺傳或后天胰島素分泌不足或胰島素抵抗所致的以糖代謝紊亂為主的慢性綜合性疾病。生活水平提高、體力勞動(dòng)減少、人口老齡化及肥胖發(fā)生率的增加等多種因素,致使糖尿病的發(fā)病率有逐年上升的趨勢,現(xiàn)已成為繼腫瘤、心腦血管疾病之后的第三位嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病,被世界衛(wèi)生組織稱為“21世紀(jì)的災(zāi)難”。目前我國有糖尿病患者9200多萬,成為全球第一糖尿病大國,其中約97％患者屬于2型糖尿病(2DM)。更為嚴(yán)重的是糖尿病的發(fā)病有年輕化的趨勢,

2、甚至一些肥胖、超重的兒童、青少年也患上了糖尿病。
　　 目前,對于1型糖尿病(1DM)治療的研究方向是開發(fā)給藥方便、有效的胰島素制劑及其代用品；對于治療2DM的藥物,根據(jù)藥理作用的機(jī)制不同,分為胰島素及其同類藥物、胰島素增敏劑、胰島素促泌劑、減少碳水化合物調(diào)節(jié)劑等。但是傳統(tǒng)的糖尿病治療藥物降糖療效有限,且無法根本阻止胰島β細(xì)胞的進(jìn)一步壞死。隨著人們對糖尿病發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入,許多治療糖尿病的新型藥物不斷問世。研發(fā)藥物的方向也

3、從糖尿病發(fā)病機(jī)制的分子機(jī)理切入,尋找可能的藥物作用靶點(diǎn)。其中主要的研究熱點(diǎn)相對集中在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和糖尿病代謝途徑中相關(guān)的蛋白和調(diào)控因子。
　　 糖尿病屬于中醫(yī)消渴癥范疇,幾千年的中醫(yī)文化和豐富的中草藥積累了豐富的中草藥降糖經(jīng)驗(yàn)。降血糖中藥新藥越來越受到關(guān)注,尤其是從中藥中篩選出來的具有降糖作用的藥物及有效成分的研究,已成為抗糖尿病藥物的研究熱點(diǎn)和開發(fā)方向。
　　 黃芪(Astragalus membranaceus

4、)藥用迄今已有2000多年的歷史,現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí),黃芪含皂甙、蔗糖、多糖、多種氨基酸、葉酸及硒、鋅、銅等多種微量元素；有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗應(yīng)激、降壓和廣泛的抗菌作用。據(jù)相關(guān)報(bào)道,黃芪對糖尿病患者具有增加胰島素敏感性和降低血糖的作用。黃芪可通過增加糖原合成酶活性、胰島素受體底物活性、蛋白激酶B和蛋白激酶C活性,使骨骼肌細(xì)胞、心肌組織葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平增加,使糖原合成酶活性增加而增加胰島素敏感性,從而發(fā)揮降低血糖作

5、用。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食聯(lián)合化學(xué)藥物鏈脲左菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠糖尿病模型,研究黃芪甲苷對糖尿病小鼠血糖、血脂以及胰島素水平的作用。采用基因芯片方法研究黃芪甲苷降血糖作用可能的分子靶點(diǎn)。接下來我們選取糖代謝途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶:肝糖原磷酸化酶和肝葡萄糖-6-磷酸酶,進(jìn)行下一步研究；我們采用酶活性法、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Westernblot法研究黃芪甲苷對這兩個(gè)酶的影響,

6、擬闡明其降血糖作用的分子機(jī)制。
　　 研究的主要方法和結(jié)果如下:
　　 一、采用高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)C57BL/6J糖尿病小鼠模型,評價(jià)不同劑量黃芪甲苷對糖尿病小鼠血糖、體重、總膽固醇、甘油三酯和胰島素水平的影響。雄性C57BL/6J小鼠,隨機(jī)分成普通飼料組和高脂飲食(Hi曲fat diet,HFD)組,用普通飼料和高脂飼料分別喂養(yǎng)3周后,普通飼料組小鼠腹腔注射檸檬酸緩沖液一次,高脂飲食組小鼠給予STZ100mg/kg

7、腹腔注射一次。注射2周后用血糖儀測定血糖,選取血糖水平在10.0-20.0mmol/L之間的小鼠作為糖尿病模型。繼續(xù)用原飲食喂養(yǎng)3周后將小鼠分成正?？瞻讓φ战M(Control groups),糖尿病模型組(HFD+STZ groups)和糖尿病黃芪甲苷治療組(HFD+STZ+Geniposide 12.5mg/kg,25mg/kg,50mg/kg)。糖尿病模型組(HFD+STZ)小鼠的平均血糖明顯升高,與正?？瞻讓φ战M(Control

8、groups)比較有顯著差異(P<0.05)。
　　 分別用12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg的黃芪甲苷給糖尿病小鼠灌胃,每日兩次,連續(xù)灌胃3周之后用血糖儀測定小鼠血糖；分別用總膽固醇酶聯(lián)免疫分析試劑盒、甘油三酯檢測試劑盒、胰島素檢測試劑盒檢測小鼠血中的總膽固醇、甘油三酯和胰島素水平,觀察不同劑量的黃芪甲苷對糖尿病小鼠的血糖、體重、血脂(甘油三酯和膽固醇)和胰島素水平的作用。結(jié)果表明,黃芪甲苷25mg/kg和50

9、mg/kg治療組與糖尿病模型組小鼠比較,其血糖、體重、總膽固醇水平和胰島素水平均顯著降低(P<0.05),12.5mg/kg黃芪甲苷治療組小鼠與糖尿病模型組小鼠比較血糖、體重、甘油三酯水平及胰島素水平均無顯著差異(P>0.05),黃芪甲苷12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg治療組與糖尿病模型組小鼠比較總膽固醇水平變化無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果說明黃芪甲苷能降低糖尿病小鼠的血糖、體重、甘油三酯及胰島素水平,對總膽固醇

10、水平影響不大。
　　 二、基因芯片法研究黃芪甲苷對高脂飲食聯(lián)合STZ糖尿病小鼠相關(guān)糖尿病基因的影響 使用SuperArray的RT2 Profiler TM PCR芯片,Prism 7900測試系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。芯片上包含了與糖尿病發(fā)生、發(fā)展和惡化相關(guān)的84個(gè)基因,根據(jù)基因的功能分為受體、轉(zhuǎn)運(yùn)及通道蛋白、核受體、代謝酶、分泌因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子及其他共七大類基因組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)50mg/kg黃芪甲苷治療組下調(diào)了六大類1

11、9個(gè)基因水平,上調(diào)了六大類24個(gè)基因水平。下調(diào)基因包括:受體、轉(zhuǎn)運(yùn)、通道蛋白類的突觸結(jié)合蛋白、囊泡膜蛋白、白介素4受體、癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子、胰高血糖素受體；代謝酶類的聚合 ADP核糖、肝糖原磷酸酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸酶、果糖二磷酸酶、二肽激肽酶4；分泌因子類的胰島素、血管上皮生長因子、白介素-12b；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)類的磷脂?；?3-激酶；轉(zhuǎn)錄因子類的轉(zhuǎn)錄因子1、叉頭框G1、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合因子；核受體類的過氧化物酶

12、增殖活化受體。上調(diào)基因包括:受體、轉(zhuǎn)運(yùn)、通道蛋白類的細(xì)胞粘附分子、腫瘤壞死因子受體超家族a、腫瘤壞死因子受體超家族b、RAS癌基因家族、選擇素；代謝酶類的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅰ、超氧化物歧化酶、葡萄糖激酶、一氧化氮合酶和血紅素氧化酶1；分泌因子類的血管緊張素、趨化因子受體 2、腫瘤壞死因子、抵抗素、白介素-6、白介素-10；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)類的叉頭框C2、胰島素啟動(dòng)因子1；其他類的非偶聯(lián)蛋白和絲氨酸肽酶抑制劑。
　　 三、采用酶活性法、熒光

13、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time RT-PCR)法和Western blot法研究黃芪甲苷對與糖代謝相關(guān)的肝糖原磷酸化酶和肝葡萄糖-6-磷酸酶的作用。
　　 在上面的實(shí)驗(yàn)中,我們從黃芪甲苷誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)的基因中,選取2個(gè)與糖代謝密切相關(guān)的基因,即GP和G6Pase的基因Pygl和G6pc；采用酶活性法、熒光定量RT-PCR法和Western blot法對兩個(gè)酶的活性、mRNA水平和蛋白表達(dá)進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。
　　

14、 結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能降低糖原磷酸化酶和葡萄糖-6-磷酸酶的活性,減少其mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　 本論文得出如下結(jié)論:
　　 一、我們使用高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠成功造成了糖尿病小鼠模型,模型小鼠的血糖升高,與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致。
　　 二、黃芪甲苷能降低高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的C57BIJ6J糖尿病小鼠的血糖、甘油三酯和胰島素水平,但對總膽固醇水平無明顯影響。
　　 三、用包含有與糖尿病

15、發(fā)生、發(fā)展與惡化相關(guān)的84個(gè)基因的第二代基因芯片檢測結(jié)果提示,黃芪甲苷能上調(diào)24個(gè)基因,下調(diào)19個(gè)基因。黃芪甲苷下調(diào)與糖代謝相關(guān)的酶基因肝糖原磷酸化酶2.74倍,葡萄糖-6-磷酸酶45.20倍。
　　 四、肝酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黃芪甲苷能明顯抑制糖尿病小鼠肝糖原磷酸化酶和肝葡萄糖-6-磷酸酶的活性,實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了黃芪甲苷能顯著抑制糖尿病小鼠血清中GP和G-6-Pase的mRNA和蛋白的