RNA干擾技術(shù)阻斷黏著斑激酶表達(dá)對肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是多種致病因子引起慢性肝病，進(jìn)而發(fā)展為肝硬化的共有病理改變和必經(jīng)途徑。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化、增殖進(jìn)而合成大量的膠原等細(xì)胞外間質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。因此，抑制HSCs活化、增殖并誘導(dǎo)其凋亡是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵所在。
　　 黏著斑激酶（focal adhesion kin

2、ase，F(xiàn)AK）是整合素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中連接整合素與下游信號分子的媒介，處于細(xì)胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點(diǎn)，能激活多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。FAK被激活后可以調(diào)節(jié)其下游信號分子，引起細(xì)胞骨架重組和多種基因表達(dá)，如可以通過Ras依賴的絲裂源活化蛋白激酶（Mitogen Activated Protein Kinases，MAPK）途徑引起級聯(lián)反應(yīng)，參與細(xì)胞鋪展、增殖、分化與凋亡等多種生物學(xué)行為。多項(xiàng)研究表明FAK在成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及

3、多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但對HSCs增殖與凋亡的影響知之尚少。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是目前最有效的基因沉默技術(shù)，能特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)相應(yīng)蛋白水平及功能。
　　 為此，我們采用RNAi技術(shù)，以FAK為切入點(diǎn)，在前期應(yīng)用含U6啟動子及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的質(zhì)粒載體pEGFP成功構(gòu)建靶向FAK

4、的短發(fā)卡RNA（shRNA）干擾重組體的基礎(chǔ)上，在陽離子聚合物介導(dǎo)下將干擾質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HSCs，研究特異性阻斷FAK表達(dá)對纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）刺激的HSCs增殖與凋亡的影響及其機(jī)制。
　　 目的：采用RNAi技術(shù)，探討FAK shRNA對HSCs增殖、凋亡的影響以及FAK介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、bcl-2、bax在HSCs增殖與凋亡中的作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)HSCs，并以FN刺激HSCs增殖，在

5、陽離子聚合物梭華-sofastTM介導(dǎo)下，應(yīng)用FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6。實(shí)驗(yàn)分5組：①空白對照組（簡寫為Con組）；②FN刺激組（簡寫為FN組）；③轉(zhuǎn)染試劑組（簡寫為sofast組）；④pEGFP-HK shRNA組（簡寫為HK組）；⑤pEGFP-FAK shRNA組（簡寫為FAK shRNA組）；②～⑤組中FN濃度均為10μg·mL-1。
　　 采用MTT法測定HSCs增殖；流式細(xì)胞術(shù)（flow

6、cytometry，F(xiàn)CM）、末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）法與透射電鏡技術(shù)檢測HSCs的凋亡；采用Western blot及real-time Q-PCR等實(shí)驗(yàn)方法，檢測FAK、ERK1、bcl-2、bax與caspase-3蛋白及其mRNA表達(dá)；Western

7、 blot實(shí)驗(yàn)方法檢測轉(zhuǎn)染前后p-FAK、p-ERK蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：①FAK shRNA抑制FAK mRNA表達(dá)：real-time Q-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后FN組FAK mRNA表達(dá)較Con組升高57.00％，P<0.01，但與sofast組、HK組之間無顯著性差異；FAK shRNA組FAK mRNA表達(dá)水平較HK組顯著下降，P<0.01，且最高下調(diào)率為76.73％，出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后24 h；②FAKshRNA抑制F

8、AK表達(dá)及活化：Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)N刺激后HSCs FAK的蛋白表達(dá)量較Con組升高49.70％，P<0.01，但與sofast組、HK組比較無明顯差異，P>0.05； FAK shRNA組FAK蛋白表達(dá)量較HK組顯著降低，P<0.01，且最高下調(diào)率為72.53％，出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后48 h。p-FAK（Tyr397）蛋白表達(dá)亦表現(xiàn)出相似的變化：FAK shRNA組p-FAK（Tyr397）蛋白較HK組顯著下降，P<0.01

9、，且最高下調(diào)率出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后48 h，與FAK蛋白的表達(dá)水平變化一致，表明FAK shRNA干預(yù)HSCs可明顯抑制FAK磷酸化；③FAK shRNA抑制ERK1 mRNA表達(dá)：real-time Q-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)AK shRNA組ERK1 mRNA表達(dá)較HK組顯著下降，P<0.01，且最高下調(diào)率為55.67％，出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后48 h；④FAK shRNA抑制ERK1表達(dá)及活化：Western blot顯示FN刺激后HSCs的ERK1蛋

10、白表達(dá)量較Con組升高77.55％，P<0.01，但與sofast組、HK組比較無明顯差異；FAK shRNA組ERK1蛋白表達(dá)量顯著降低，較HK組下降了65.13％，P<0.01。同時，p-ERK1的變化也表現(xiàn)出相似的趨勢，其最高下調(diào)率為75.47％，出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后72 h；⑤FAKshRNA抑制HSCs增殖：在96孔板內(nèi)轉(zhuǎn)染FAK shRNA質(zhì)粒，采用MTT方法檢測顯示，F(xiàn)AK shRNA組與HK組相比，對HSCs增殖有顯著抑制作用，

11、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染12 h、24 h、48 h后增殖抑制率分別為11.08％、15.12％、28.62％，呈時間依賴性關(guān)系；⑥FAK shRNA促進(jìn)HSCs凋亡：FAK shRNA轉(zhuǎn)染HSCs24h后，采用FCM檢測HSCs凋亡，結(jié)果顯示：FN組HSCs凋亡率較Con組降低48.73％，P<0.01，但與sofast組、HK組之間無明顯差異；FAK shRNA組HSCs凋亡率較HK組明顯增高（8.29％±0.79％ vs2.70％±0.31％），

12、P<0.01。同時采用TUNEL法顯示：FN組HSCs凋亡率較Con組降低52.01％，P<0.01，但與sofast組、HK組之間無明顯差異；FAK shRNA組HSCs凋亡率較HK組明顯增高（19.00％±0.92％ vs7.63％±0.70％），P<0.01。透射電鏡可觀察到FAK shRNA組中大量的HSCs細(xì)胞膜皺縮，胞漿濃縮，核染色質(zhì)凝集、固縮，聚集于核膜下呈境界分明的團(tuán)塊狀、花瓣?duì)罨蛐略麦w形，有的可見核碎裂及凋亡小體形成；

13、⑦caspase-3表達(dá)增強(qiáng)：real-time Q-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)N組caspase-3 mRNA表達(dá)較Con組降低35.00％，P<0.05，但與sofast組、HK組之間無明顯差異；FAK shRNA組caspase-3 mRNA表達(dá)較HK組明顯升高，P<0.01，且最高上調(diào)率為60.71％，出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后36h。Westernblot顯示FN刺激后HSCs caspase-3蛋白表達(dá)量較Con組降低20.87％，P<0.05，

14、但與sofast組、HK組比較無明顯差異；FAKshRNA組caspase-3蛋白表達(dá)量較HK組顯著升高，P<0.01，且最高上調(diào)率為75.29％，出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后48 h；⑧bcl-2/bax比值降低：real-time Q-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)N組bax mRNA表達(dá)較Con組降低33.00％，P<0.01，但與sofast組、HK組之間無明顯差異；FAK shRNA組bax mRNA表達(dá)較HK組明顯升高，P<0.01，且最高上調(diào)率為65

15、.82％，出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后36h。Western blot顯示FN刺激后HSCs的bax蛋白表達(dá)量較Con組降低19.08％，P<0.01，但與sofast組、HK組比較無明顯差異，F(xiàn)AKshRNA組bax蛋白表達(dá)量較HK組顯著升高，P<0.01，且最高上調(diào)率為66.06％，出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后48 h。real-time Q-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)N組bcl-2 mRNA表達(dá)較Con組升高35.00％，P<0.01，但與sofast組、HK組之間無明

16、顯差異；FAK shRNA組bcl-2 mRNA表達(dá)較HK組明顯降低，P<0.01，且最高下調(diào)率為48.03％，出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后36h。Western blot顯示FN刺激后HSCs bcl-2蛋白表達(dá)量較Con組升高69.53％，P<0.01，但與sofast組、HK組比較無明顯差異；FAK shRNA組bcl-2蛋白表達(dá)量較HK組顯著降低，P<0.01，且最高下調(diào)率為71.90％，出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后48 h。分別把各組中bcl-2、bax翻譯

17、和轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)作一比值，可見在翻譯水平和轉(zhuǎn)錄水平，F(xiàn)AK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSCs后降低了bcl-2/bax比值。
　　 結(jié)論：在陽離子聚合物介導(dǎo)下瞬時轉(zhuǎn)染靶向FAK的shRNA質(zhì)粒，可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)FAK表達(dá)，伴隨FAK活性的下降，ERK1的表達(dá)亦表現(xiàn)出相似的變化，并可以呈時間依賴性地抑制FN刺激的HSCs增殖，此可能與抑制FAK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)；可以誘導(dǎo)FN刺激的HSCs發(fā)生凋亡，并在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測到c