骨髓增生異常綜合征腫瘤標(biāo)志物及相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制的研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　第一部分、應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)研究骨髓增生異常綜合征腫瘤相關(guān)標(biāo)志物
　　骨髓增生異常綜合征(MDS)是一類異質(zhì)性較高的疾病。部分患者可在發(fā)病后1年內(nèi)即轉(zhuǎn)變成急性白血病(AML)，這里稱之為tMDS(transformedMDS)；而另一些患者則可長(zhǎng)期保持穩(wěn)定而不進(jìn)展為AML，稱作sMDS(stable MDS)。Kunju等人(2009)對(duì)MDS骨髓CD34+細(xì)胞的cDNA芯片研究中顯示，這兩組預(yù)后不同

2、的MDS患者具有不同的基因表達(dá)譜(GEP)特點(diǎn)。而作為一種高通量的蛋白質(zhì)研究技術(shù)，蛋白質(zhì)芯片在研究腫瘤標(biāo)志物方面已經(jīng)有很多成功的應(yīng)用。
　　在本研究中，我們首次應(yīng)用人蛋白質(zhì)芯片對(duì)MDS患者血漿中相對(duì)于正常對(duì)照組異常表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行較為全面的檢測(cè)。我們檢測(cè)了64個(gè)MDS樣本，其中包括28名tMDS患者和36名sMDS患者，還檢測(cè)了13個(gè)轉(zhuǎn)白(AML post-MDS)樣本，正常對(duì)照樣本為34個(gè)，共111個(gè)血漿樣本。所有樣本均通過(guò)與包

3、含有9483個(gè)人類蛋白質(zhì)的芯片雜交而進(jìn)行檢測(cè)。所得的數(shù)據(jù)通過(guò)應(yīng)用ProCAT算法和quantile校正進(jìn)行芯片內(nèi)部和芯片之間的校正和標(biāo)準(zhǔn)化。然后再對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)假設(shè)檢驗(yàn)，得出了相對(duì)于正常對(duì)照組有顯著差異的蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)組(p<0.01)。sMDS組有36個(gè)反應(yīng)性顯著增高的蛋白，其中4個(gè)也出現(xiàn)于tMDS中(如ARL8，PLK1)，2個(gè)還出現(xiàn)于AML/MDS中（如FGF16）；在tMDS組有8個(gè)反應(yīng)性顯著增高的蛋白質(zhì)，其中4個(gè)也出現(xiàn)于sM

4、DS中，2個(gè)可見(jiàn)于AML/MDS中(如LGALS1); AML/MDS組有5個(gè)反應(yīng)性增高較為顯著的蛋白質(zhì)，其中與sMDS和tMDS表現(xiàn)重合的各為2個(gè)。例如，在tMDS組，DLEU（抑癌因子，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖）和ARL8（ADP糖基化因子樣蛋白8，促進(jìn)細(xì)胞增殖）具有較高的顯著性；在sMDS組中可見(jiàn)AKT3(絲/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，促增殖因子)和BAG1（原癌基因BCL-2的分子伴侶，具有抗凋亡作用）顯著升高；而在AML/MD

5、S中有FGF16（成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子16，促增殖因子）表現(xiàn)為顯著升高。
　　這些蛋白質(zhì)參與體內(nèi)許多生物過(guò)程，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等等。一些高表達(dá)的蛋白質(zhì)中有一部分與cDNA芯片的結(jié)果一致（如AKT3和FGF16）。而且，這些蛋白標(biāo)志物與IPSS評(píng)分也顯示出很高的相關(guān)性。我們的實(shí)踐表明蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是MDS腫瘤血漿標(biāo)志物研究的有力工具，在研究中我們篩選出MDS患者血漿中一些潛在的腫瘤標(biāo)志物及疾病進(jìn)展相關(guān)標(biāo)志物。這對(duì)于促進(jìn)MDS

6、患者的臨床診斷和預(yù)后判斷具有積極地意義。
　　第二部分、單純Sq-/伴5q-異常MDS患者RPS14表達(dá)水平及其與造血細(xì)胞凋亡關(guān)系
　　目的：探討Sq-核型異常的骨髓增生異常綜合征(MDS)患者核糖體蛋白(RP) S14的表達(dá)水平及與骨髓造血細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　方法：采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)18例單純5q-異常（7例）或Sq-伴有其他染色體異常（11例）MDS患者RPS14、MDM2、p53的mRNA表達(dá)水平，同時(shí)

7、采用堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶(APAAP)方法檢測(cè)患者骨髓有核細(xì)胞p53蛋白表達(dá)，并同步采用TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端（熒光）標(biāo)記（TUNEL）法檢測(cè)骨髓細(xì)胞凋亡，10例正常人作為對(duì)照。
　　結(jié)果：15/18例(83.3％)伴有5q-異常患者骨髓細(xì)胞RPS14表達(dá)降低，其中6/7例單純5q-異?；颊弑磉_(dá)降低，9/11例5q-伴其他核型異常患者表達(dá)降低；RPS14表達(dá)與MDM2、p53表達(dá)水平均呈正相關(guān)，而p53表達(dá)與骨髓細(xì)胞凋亡呈

8、負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：Sq-/5q-伴其他核型異?；颊逺PS14表達(dá)下降，并可能通過(guò)MDM2降低p53表達(dá)導(dǎo)致骨髓造血細(xì)胞過(guò)度凋亡。
　　第三部分、IGF-IR作為骨髓增生異常綜合征骨髓克隆細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的研究
　　目的：胰島素樣生長(zhǎng)因子I型受體(IGF-IR)具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，抑制細(xì)胞凋亡的功能，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)IGF-IR在MDS骨髓有核細(xì)胞表達(dá)明顯增高，在高危組MDS的表達(dá)

9、增高更為明顯。為了進(jìn)一步研究IGF-IR在MDS骨髓造血干細(xì)胞中的表達(dá)狀況及其與MDS預(yù)后的關(guān)系；以及探索IGF-IR對(duì)MDS骨髓克隆細(xì)胞的標(biāo)志性作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了本課題。
　　方法：1．在擴(kuò)大病例的同時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)IGF-IR在MDS患者骨髓CD34+細(xì)胞中的表達(dá)狀況；2．應(yīng)用免疫磁珠法對(duì)MDS患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行紅系分選，對(duì)分選出的不含紅細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行FISH檢測(cè)從而觀察去紅后單個(gè)核細(xì)胞IGF-IR表達(dá)與

10、克隆細(xì)胞的相關(guān)性；3．應(yīng)用FCM進(jìn)行IGF-IR陽(yáng)性細(xì)胞分選，通過(guò)對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞的FISH檢測(cè)進(jìn)行克隆細(xì)胞純化實(shí)驗(yàn)，從而進(jìn)一步證實(shí)IGF-IR在克隆細(xì)胞中的特異性表達(dá)及其對(duì)克隆細(xì)胞的純化效率。
　　結(jié)果：1．IGF-IR在MDS患者骨髓CD34+細(xì)胞中高表達(dá)，其中IPSS評(píng)分低危／中危．1(IPSS≤1)組和中危-2/高危組(IPSS≥1.5)患者的IGF-IR表達(dá)具有顯著差異(p<0.05，p=0.0128)，提示IGF-IR在MD