TLR4對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞分泌Il-1β、TNF-α的影響.pdf

1、本文主要從以下兩個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)
　　目的:分離大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜組織，培養(yǎng)滑膜成纖維細(xì)胞，并建立穩(wěn)定的滑膜成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。
　　方法:取大鼠顳下頜關(guān)節(jié)雙板區(qū)的滑膜組織，采用酶消化法分離培養(yǎng)原代滑膜細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)波形蛋白(vimenin)和CD68的表達(dá)。
　　結(jié)果:倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈梭形，細(xì)

2、胞外形均勻一致，具有成纖維細(xì)胞的形態(tài)，所有培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞均對(duì)CD68蛋白表達(dá)陰性，波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性。
　　結(jié)論:采用酶消化法可成功分離培養(yǎng)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 TLR4對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α的影響
　　目的:研究Toll樣受體-4(Toll like receptors4，TLR4)對(duì)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)

3、誘導(dǎo)的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α的影響，探討TLR4在顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:以終濃度為0，0.1，1，10，100 ng/mL的LPS刺激滑膜成纖維細(xì)胞12h，或以LPS（終濃度100ng/mL）刺激細(xì)胞0，1，6，12，24h，檢測(cè)LPS刺激與IL-1β、TNF-α表達(dá)的量效和時(shí)效性關(guān)系，選擇最佳的刺激濃度與時(shí)間。應(yīng)用LPS刺激細(xì)胞，Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TLR

4、4、MyD88的表達(dá)變化，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-α的表達(dá)情況，應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)變化。用TLR4的特異性抑制劑TAK-242預(yù)處理滑膜成纖維細(xì)胞后，再加入LPS刺激細(xì)胞，應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)IL-1β、 TNF-αmRNA

5、的表達(dá)變化，采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-α的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:經(jīng)LPS刺激后，隨著LPS刺激濃度的增加IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白表達(dá)量逐漸升高。并且，二者與LPS刺激持續(xù)時(shí)間呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴關(guān)系，IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)量在12h到達(dá)高峰，IL-1β、TNF-αmRNA在6h到達(dá)高峰。LPS能夠明顯增強(qiáng)TLR4、MyD88 mRNA及蛋白表達(dá)，TAK-242的應(yīng)用能顯著抑制LPS誘導(dǎo)