鈦基種植體表面仿細(xì)胞外基質(zhì)活性涂層的設(shè)計、構(gòu)建及其生物學(xué)評價.pdf

1、縮短種植體骨整合時間，達(dá)到種植體即刻負(fù)載或早期負(fù)載是種植體表面改性研究的主要目標(biāo)。本研究從仿生的視角，采用層層自組裝的方法(LbL technique)，在純鈦片表面以設(shè)計、構(gòu)建仿細(xì)胞外基質(zhì)活性涂層為目標(biāo)，進(jìn)行了方法學(xué)探討。在此基礎(chǔ)上，對各種涂層進(jìn)行了詳細(xì)的生物學(xué)評價。
　　 首先，純鈦片表面經(jīng)打磨拋光及氧化性混酸溶液處理，得到我們需要的基底面。研究表明這是一個富含羥基且具有良好生物活性的基底面，由于羥基與富含氨基的聚電解質(zhì)生物

2、大分子之間的氫鍵作用，為我們后續(xù)的組裝提供了可能。接著選擇了4種具有良好骨誘導(dǎo)性的生物大分子（Ⅰ型膠原、殼聚糖、透明質(zhì)酸和多聚谷氨酸），根據(jù)它們等電點(diǎn)的不同配成帶電荷的聚電解質(zhì)溶液（Ⅰ型膠原和殼聚糖帶正電荷，透明質(zhì)酸和多聚谷氨酸負(fù)電荷），通過層層自組裝技術(shù)將上述聚電解質(zhì)兩兩配比組裝到純鈦基底面上，共得到4種不同的涂層并進(jìn)行表征。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)與純鈦基底面相比，涂層的表面形貌發(fā)生了改變，也是布滿了各種不同大小的納米級別的顆粒；AFM檢測

3、結(jié)果也證實了相同的變化趨勢。X射線光電子能譜儀分析發(fā)現(xiàn)涂層表面元素成分氮的含量隨著組裝層數(shù)的增加而不斷升高；而石英晶體微量天平檢測的涂層厚度也在隨著組裝層數(shù)的增加而不斷增厚；最后，接觸角實驗顯示涂層表面的可濕性隨著鈦片表面聚電解質(zhì)組裝層數(shù)的變化而不斷變化。以上結(jié)果證明我們所選擇的有機(jī)質(zhì)大分子被成功的組裝到了純鈦表面。接著，在各種涂層上體外培養(yǎng)成骨前體細(xì)胞(MC3T3-E1)，觀察細(xì)胞的粘附、增殖和分化情況。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)以Ⅰ型膠原和透明質(zhì)

4、酸為骨架的涂層最有利于成骨前體細(xì)胞的生長。
　　 接下來，我們設(shè)計合成了GRGDSPC多肽序列，并將該多肽序列引入到透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)中，然后利用自組裝的方法構(gòu)建了膠原/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。由于該多肽序列中端基為半胱氨酸殘基，該殘基中有活潑的巰基，而巰基之間可以在溫和的條件下進(jìn)行交聯(lián)形成雙硫鍵，從而使得最后的膠原/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合膜穩(wěn)定。這樣，我們在引入RGD序列的同時，亦實現(xiàn)了聚電復(fù)合膜的交聯(lián)。體外降解研究顯示，該交聯(lián)的膠原

5、/透明質(zhì)酸復(fù)合膜穩(wěn)定性顯著提高；不僅如此，該涂層對谷胱甘肽具有降解響應(yīng)性，在谷胱甘肽模擬體液中的降解速度大大提高，暗示這種涂層可以在體內(nèi)通過谷胱甘肽而加速降解。體外生物學(xué)評價顯示：與膠原/透明質(zhì)酸涂層相比，引入RGD的涂層顯著不僅促進(jìn)了成骨前體細(xì)胞的粘附，而且也促進(jìn)了成骨前體細(xì)胞的增殖、分化和鈣化。
　　 在此基礎(chǔ)上，我們計劃在種植體表面的涂層中引入活性生長因子。BMP-2分子由于具有強(qiáng)烈的骨誘導(dǎo)性而備受關(guān)注，本實驗也選擇BMP

6、-2作為研究對象。首先將BMP-2溶入膠原溶液而帶上正電荷，接著通過LBL技術(shù)將BMP-2引入到涂層中，接下來同樣將涂層交聯(lián)。體外降解實驗表明，該涂層在增加穩(wěn)定性的同時也實現(xiàn)了對BMP-2分子的緩釋作用，而釋放出來的BMP-2分子也沒有喪失原有的活性。生物學(xué)評價結(jié)果也表明，與RGD功能化的膠原/透明質(zhì)酸復(fù)合膜相比，該活性涂層顯著促進(jìn)了細(xì)胞的分化和功能表達(dá)。與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能類似，該涂層不僅僅是作為成骨細(xì)胞的支架讓其黏附生長，而且涂層

7、中的RGD序列與緩釋出來的生長因子能夠通過與整合素或其它特定的細(xì)胞表面受體與成骨細(xì)胞直接或間接的作用，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長、遷移和分化，因而具有明顯的仿生特征。
　　 不僅如此，當(dāng)以同樣的策略在已經(jīng)引入RGD的膠原/透明質(zhì)酸復(fù)合膜中組裝bFGF分子（最近的研究發(fā)現(xiàn)bFGF不僅能刺激血管的再生，也能明顯促進(jìn)成骨），也取得了成功，同樣使涂層穩(wěn)定性大大提高，也具有對bFGF分子的緩釋功能。同樣較RGD功能化的膠原/透明質(zhì)酸復(fù)合膜促進(jìn)

8、了成骨細(xì)胞的分化和鈣化，該活性涂層也具有仿生的特點(diǎn)。
　　 最后，我們在涂層中同時組裝上BMP-2和bFGF分子，降解結(jié)果顯示該涂層實現(xiàn)了對BMP-2和bFGF分子的緩釋作用，而且BMP-2和bFGF它們之間能獨(dú)立釋放，互不干擾。生物學(xué)評價結(jié)果顯示，組裝了多個生長因子的活性涂層與分別組裝BMP-2或bFGF或RGD功能化的涂層相比較，該涂層顯著促進(jìn)了成骨細(xì)胞的黏附增殖和分化，而且BMP-2和bFGF分子之間具有明顯的協(xié)同作用。這