TRAP1基因沉默和基因過表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路影響的研究.pdf

1、研究背景和目的
　　 腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)是一種多功能細(xì)胞因子,由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等分泌產(chǎn)生,在生物機(jī)體的各個(gè)反應(yīng)中具有重要作用,包括炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤與微生物感染等方面。TNF的生物學(xué)功能通過細(xì)胞表面相應(yīng)的受體來實(shí)現(xiàn)。TNF受體家族主要是Ⅰ型膜蛋白受體,TNF-α有兩類受體,分子量分別是55kD(TNFR-Ⅰ)和75kD(TNFR-Ⅱ)。TNFR-Ⅰ廣泛分布于正常

2、細(xì)胞膜以及多種腫瘤細(xì)胞膜表面,TNFR-Ⅱ主要分布于造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。兩類受體的胞外區(qū)有28％的同源性,而胞內(nèi)區(qū)沒有同源性,提示兩者介導(dǎo)了不同的信號(hào)傳遞途徑。TNFR-Ⅰ參與介導(dǎo)細(xì)胞活化信號(hào)和增殖信號(hào),誘導(dǎo)一氧化氮合成酶和白介素8的活性,活化NF-kB,亦可誘導(dǎo)凋亡、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、抗病毒、促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖等；而TNFR-Ⅱ主要調(diào)控胸腺細(xì)胞的增殖,抑制造血和調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞或中性粒細(xì)胞活性等。TNF/TNFR系統(tǒng)不僅是重要的炎癥因子,而且

3、對(duì)細(xì)菌感染,某些自身免疫疾病和退化性疾病有保護(hù)功能。TNF與TNFR結(jié)合以后,一方面介導(dǎo)凋亡信號(hào),在抗腫瘤和抗病毒感染中發(fā)揮重要作用,另一方面也參與自身免疫性疾病和敗血癥中對(duì)自身組織細(xì)胞的損傷。TNFR的生物學(xué)活性受諸多因素影響,包括遺傳和環(huán)境因素,細(xì)胞分化以及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)間的信息傳遞等。
　　 FNF受體相關(guān)蛋白1(TNFR associated protein1,TRAP1)是在1995年鑒定出來的HSP90家族的一個(gè)成員,

4、與腫瘤壞死因子1類受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。其結(jié)構(gòu)與熱休克蛋白75相似,主要定位于線粒體,在心臟肌原纖維、心臟細(xì)胞核、胰腺以及血管內(nèi)皮細(xì)胞表面也有定位。近年來研究發(fā)現(xiàn),TRAP1不但具有HSP90家族的共同特點(diǎn),如在氧化應(yīng)激時(shí)保護(hù)細(xì)胞,維持線粒體膜穩(wěn)定、抑制活性氧的產(chǎn)生,避免凋亡；TRAP1還有不同于HSP90家族其他成員的獨(dú)特特點(diǎn),在于其特有的LxCxE模序,該模序可與Rb蛋白的SV40T抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合,在有絲分裂和熱休克應(yīng)激后,T

5、RAP1可從線粒體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),并借此結(jié)構(gòu)域與Rb結(jié)合,參與輔助變性的Rb重新折疊,恢復(fù)其天然構(gòu)象及功能,因此,TRAP1可做為Rb的分子伴侶,協(xié)助其調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程,而HSPs其他成員則沒有此模序及此功能。
　　 熱休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)又被稱作“分子伴侶”(molecularchaperone),當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激因素作用或處于病理生理狀態(tài)下(如低氧、感染性炎癥、缺血等)均可誘發(fā)熱休克蛋

6、白合成和表達(dá)增加。研究發(fā)現(xiàn),許多腫瘤細(xì)胞可高度表達(dá)或特異表達(dá)不同亞族的HSP,認(rèn)為HSP的表達(dá)參與了基因調(diào)控及細(xì)胞周期調(diào)控,與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移及凋亡有關(guān),并與癌基因和抑癌基因有著密切關(guān)系,可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后及機(jī)體對(duì)抗腫瘤藥物的耐藥性等有關(guān)。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),TRAP1雖然在多數(shù)腫瘤中高表達(dá),在某些腫瘤如非小細(xì)胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌中反而低表達(dá)。后繼研究發(fā)現(xiàn)TRAP1在調(diào)節(jié)Rb/E2F1途徑中發(fā)揮重

7、要作用,影響細(xì)胞周期進(jìn)程中 G1/S期的轉(zhuǎn)換。這一結(jié)果促使我們繼續(xù)研究 TRAP1在腫瘤細(xì)胞中的相關(guān)基因和信號(hào)通路,以期發(fā)現(xiàn) TRAP1不同于其他分子伴侶的獨(dú)特特點(diǎn),為治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 本研究運(yùn)用人類寡核苷酸芯片技術(shù)篩選 TRAP1在腫瘤細(xì)胞中的相關(guān)基因,選用高表達(dá) TRAP1的A549肺腺癌細(xì)胞系和低表達(dá)TRAP1的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系,該兩細(xì)胞系均為高度侵襲性,均表達(dá)Rb及E2F1。利用小干擾RNA技術(shù)和

8、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在兩個(gè)細(xì)胞系中分別敲低和過表達(dá) TRAP1,進(jìn)行16小時(shí)的常氧或缺氧處理,在兩個(gè)細(xì)胞系中分別比較在常氧和急性缺氧的初期,TRAP1表達(dá)高低不同所引起的相關(guān)基因的變化,將得到的差異表達(dá)基因列表上傳至在線生物信息學(xué)分析軟件進(jìn)行基因功能注釋、歸納聚類并建立基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,研究TRAP1所影響的信號(hào)途徑,探索其在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 材料和方法
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng):用siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,同時(shí)

9、以scramble RNA做為陰性對(duì)照；而用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在 MDA-MB-231中構(gòu)建長(zhǎng)效穩(wěn)定過表達(dá)TRAP1細(xì)胞株,同時(shí)以空載體轉(zhuǎn)染該細(xì)胞做為陰性對(duì)照。即得到4組細(xì)胞株:A549/siRNA和A549/Seramble,MDA231/TRAP1+和 MDA231/Mock。分別分組進(jìn)行常氧或缺氧(0.1％ O2濃度)處理16小時(shí)。
　　 2.收獲細(xì)胞,提取總RNA,用Taqman實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)TRAP1表達(dá)水平

10、,驗(yàn)證轉(zhuǎn)染的效率。
　　 3.體外擴(kuò)增RNA并純化,與熒光染料耦合,每個(gè)樣本對(duì)應(yīng)一個(gè)對(duì)照RNA,即人類通用參照總RNA。耦合后再次純化,檢測(cè)RNA濃度。
　　 4.對(duì)芯片進(jìn)行紫外偶聯(lián)并預(yù)雜交、洗片、離心干燥備用。
　　 5.將每個(gè)樣本和一個(gè)對(duì)照RNA以相同質(zhì)量混合加樣于同一張芯片上,置于42℃雜交20小時(shí)。次日洗片、離心干燥。
　　 6.在暗室用 GenePix4000B芯片掃描儀掃描芯片,每個(gè)樣本獲得一

11、個(gè)圖像,用GenePix Pro6.0軟件進(jìn)行圖像分析,將圖像轉(zhuǎn)換為數(shù)據(jù)保存。用GeneSpring TM GX10軟件對(duì)獲得的圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用LOWESS方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、標(biāo)記過濾、倍值過濾和表達(dá)水平過濾、采用對(duì)數(shù)值轉(zhuǎn)換,去除每張芯片上變異系數(shù)(CV)大于25％的數(shù)據(jù),設(shè)定比值改變(Fold change)>2.0為篩選標(biāo)準(zhǔn),獲得4個(gè)差異表達(dá)基因列表,即:常氧16小時(shí)后,A549/siRNA Vs A549/Scr,MDA2

12、31/TRAP1+Vs MDA231/Mock；缺氧16小時(shí)后,A549/siRNA Vs A549/Scr,MDA231/TRAP1+Vs MDA231/Mock。
　　 7.使用 DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)在線數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)基因的注解、功能聚類、通路分析,再用pSTIING在線數(shù)據(jù)庫建立基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

13、>　　 8.挑選6個(gè)差異表達(dá)基因,用Taqman實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性。
　　 結(jié)果
　　 1.Taqman qRT-PCR顯示,常氧和缺氧下,A549/siRNA組 TRAP1的表達(dá)水平均明顯低于A549/Scr組:而MDA231/TRAP1+組TRAP1的表達(dá)水平明顯高于 MDA231/Mock組,說明在兩個(gè)細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染均成功。
　　 2.常氧處理16小時(shí)后,A549細(xì)胞的兩個(gè)比較組中

14、有373個(gè)差異表達(dá)基因,其中A549/Scr組表達(dá)上調(diào)的基因198個(gè),下調(diào)的175個(gè)；而MDA231的兩個(gè)比較組中有163個(gè)差異表達(dá)基因,在MDA231/TRAP1+組上調(diào)的基因91個(gè),下調(diào)的72個(gè),A549細(xì)胞的差異表達(dá)基因數(shù)目大于MDA231細(xì)胞；而在缺氧處理16小時(shí)后,A549細(xì)胞系差異表達(dá)基因數(shù)目為377個(gè),其中在A549/Scr組226個(gè)上調(diào),151個(gè)下調(diào)；MDA231細(xì)胞系差異表達(dá)基因?yàn)?21個(gè),比在常氧時(shí)明顯增多。

15、　　 3.經(jīng)DAVID在線功能聚類分析,敲低 TRAP1基因時(shí)差異表達(dá)基因所參與的生物過程以及信號(hào)通路,與過表達(dá) TRAP1基因時(shí)差異表達(dá)基因所參與的生物過程以及信號(hào)通路基本相似,包括細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、免疫/炎癥反應(yīng)、血管生成、G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘附、凋亡調(diào)節(jié)、磷酸化、離子轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白水解等方面。其中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細(xì)胞周期相關(guān)基因占的比例較大。
　　 4.挑選的6個(gè)差異表達(dá)基因,用 Taqman qRT-PCR實(shí)

16、驗(yàn)驗(yàn)證了其表達(dá)水平與芯片結(jié)果一致,說明芯片結(jié)果基本可靠。
　　 5.經(jīng) pSTIING在線進(jìn)行基因相互作用網(wǎng)絡(luò)可視化,TNF途徑、NF-kB途徑、Rho激酶途徑、JNK途徑和MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑受 TRAP1的調(diào)節(jié)比較明顯。
　　 結(jié)論
　　 1.TRAP1在兩個(gè)細(xì)胞系中表達(dá)水平不同,其生理作用的重要性可能不同。在常氧下,TRAP1可能在正常表達(dá)有該蛋白的腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著更重要的作用,而低表達(dá)該蛋白的腫瘤細(xì)胞可能

17、存在其他不依賴 TRAP1的機(jī)制而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。
　　 2.敲低 TRAP1基因時(shí)差異表達(dá)基因所參與的生物過程以及信號(hào)通路,與過表達(dá) TRAP1基因時(shí)差異表達(dá)基因所參與的生物過程以及信號(hào)通路基本相似,證實(shí)了 TRAP1所影響的生物通路。
　　 3.TRAP1可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程和增殖,與 TNF途徑、Rho激酶途徑和G-蛋白偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。
　　 4.TRAP1可激活天然免疫反應(yīng),激活補(bǔ)體途徑、調(diào)

18、節(jié)巨噬細(xì)胞活性；也參與適應(yīng)性免疫反應(yīng),參與 T/B細(xì)胞活化、調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化,影響Th1或Th2細(xì)胞亞群分泌細(xì)胞因子。
　　 5.TRAP1促進(jìn)細(xì)胞的磷酸化過程,其中MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑發(fā)揮了重要作用。
　　 6.TRAP1可能抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移,與細(xì)胞粘附相關(guān)基因的差異表達(dá)上調(diào)有關(guān)。
　　 7.TRAP1可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血管生成,以滿足或維持局部腫瘤組織的血供,以盡快使腫瘤細(xì)胞擺脫缺氧狀態(tài)。
　　 8.TR