低劑量X線照射對成骨細胞形態(tài)及細胞骨架的研究.pdf

1、X射線屬于電離輻射的一種,在醫(yī)學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用,骨科疾病患者常常需要接受多次X射線的照射,而輻照的劑量屬低劑量范圍以內(nèi)。低劑量X線輻照離體成骨母細胞,發(fā)現(xiàn)可以促進成骨細胞增殖、分化過程,從而加速骨折愈合,但其具體機制尚不清楚。我們的前期研究使用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)低劑量X線照射會促進與細胞骨架相關(guān)基因的表達,可能通過細胞外基質(zhì)-局部粘附-細胞骨架途徑參與低劑量X線照射促進成骨細胞增殖、分化過程。
　　目前,有關(guān)低劑量X線照射對成骨細

2、胞骨架的研究還比較少。低劑量X線照射成骨細胞后,肌動蛋白細胞骨架的變化情況及機制尚不明了。本研究采用醫(yī)用直線加速器對成骨細胞進行0Gy(對照組)、0.5Gy(低劑量組)、5Gy(高劑量組) X線照射,觀察成骨細胞在X線照射后細胞內(nèi)微結(jié)構(gòu)及纖維肌動蛋白的變化,通過Real-Time PCR及Westtern blot技術(shù)檢測胞內(nèi)RhoA/ROCK、cofilin及其磷酸化水平變化,探討低劑量X線照射參與成骨前體細胞骨架重構(gòu)的機制,以及細胞

3、骨架重構(gòu)對成骨細胞增殖分化的影響,為進一步認識低劑量電離輻射的生物學(xué)效應(yīng)提供理論依據(jù)。本實驗分為三部分:
　　實驗一:不同劑量X線照射對成骨細胞形態(tài)及肌動蛋白細胞骨架重構(gòu)的影響
　　目的:觀察不同劑量X線照射作用于成骨細胞后,細胞形態(tài)、胞內(nèi)微結(jié)構(gòu)及纖維肌動蛋白的變化情況,為進一步研究低劑量X線照射引起成骨細胞肌動蛋白骨架重構(gòu)的機制提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法:從中國科學(xué)院細胞庫購得MC3T3-E1細胞,采用醫(yī)用直線加速器以

4、0Gy、0.5Gy、5Gy(劑量率為200 cGy/min)作用成骨細胞后,用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化,透射電鏡觀察細胞內(nèi)微結(jié)構(gòu)變化以及FITC-phalloid in對各實驗組細胞的F-actin進行染色,熒光顯微鏡下觀察各實驗組肌動蛋白細胞骨架的變化。
　　結(jié)果:0.5Gy、5Gy組細胞的F-actin在照射后2h后遭到破壞,且隨著輻射劑量的增加破壞程度越嚴重,呈劑量依賴性。但24h后細胞肌動蛋白骨架發(fā)生重構(gòu),F-ac

5、tin染色逐漸增強、纖維增粗,照射后第3天時最為顯著,但至第5天時F-actin染色逐漸恢復(fù)正常,與0Gy組接近。
　　結(jié)論:X線輻射短時間內(nèi)能使成骨前體細胞骨架破壞、F-actin解聚,但隨后細胞肌動蛋白骨架發(fā)生重構(gòu),F-actin表達增強,至第5d時逐漸恢復(fù)正常。
　　實驗二:RhoA/ROCK信號通路在介導(dǎo)低劑量X線照射引起成骨細胞肌動蛋白細胞骨架重構(gòu)中的研究
　　目的:研究RhoA/ROCK信號通路在低劑量X線

6、照射引起肌動蛋白細胞骨架重構(gòu)中的作用。
　　方法:采用醫(yī)用直線加速器以0Gy、0.5Gy、5Gy作用成骨細胞后,以Real-Time PCR及Westtern blot技術(shù)檢測細胞內(nèi)RhoA、ROCK、cofilin及磷酸化 cofilin(phospho-cofilin)水平變化。隨后以ROCK激酶特異性抑制劑Y27632預(yù)處理成骨細胞,觀察X線照射后細胞肌動蛋白骨架變化情況。
　　結(jié)果:成骨細胞經(jīng)0.5、5Gy X線照射

7、后1天,各實驗組RhoA、ROCK、phospho-cofilin含量開始升高,第3天變化最為明顯,直至5天后各實驗組RhoA、ROCK、phospho-cofilin含量趨于下降。Y27632預(yù)處理組細胞肌動蛋白骨架遭到破壞,肌動蛋白纖維排列稀疏紊亂,阻斷了低劑量X線照射引起的細胞骨架重構(gòu)。
　　結(jié)論:低劑量X線照射可以通過RhoA/ROCK信號通路引起成骨細胞肌動蛋白骨架重構(gòu)。
　　實驗三:抑制細胞骨架重構(gòu)對低劑量X線作

8、用下成骨細胞增殖分化的影響
　　目的:研究RhoA/ROCK信號通路在低劑量X線照射促進成骨細胞增殖分化過程中的作用。
　　方法:在對成骨細胞進行低劑量X線照射前,使用ROCK激酶特異性抑制劑Y-27632預(yù)處理細胞,隨后以CCK-8、ALP活性檢測、茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色、Western blot技術(shù)檢測經(jīng)0.5Gy X線照射后成骨細胞的增殖、分化情況。
　　結(jié)果:使用ROCK激酶抑制劑Y27632處理細胞后可以阻斷低劑量