家蠶細胞及絲腺退化和凋亡的程序性細胞信號通路中 BmDredd基因的功能.pdf

1、家蠶是一種重要的經(jīng)濟動物和模式昆蟲，絲腺是家蠶非常重要的吐絲器官，直接決定著家蠶產絲量的多少。在家蠶由幼蟲到蛹的變型期，絲腺器官發(fā)生了劇烈的退化，在短時間內消亡，這一過程涉及到了細胞凋亡。目前，細胞凋亡分子調控機制在哺乳動物中研究的較為清楚，但對于家蠶中的凋亡分子機制知之甚少。Dredd為caspase家族同源蛋白，本研究克隆到了家蠶BmDredd基因，并分別在細胞水平和絲腺組織水平揭示了其功能，調查了其與相關凋亡蛋白BmFadd的互作

2、關系。同時，利用高通量測序技術，進行了家蠶五齡第3天和吐絲36h后部絲腺mRNA、lncRNA與miRNA的差異表達分析，并對差異表達lncRNAs與miRNAs的靶基因做了GO功能預測。分析了BmDredd與lncRNA、miRNA的互作網(wǎng)絡。對這些內容的探索使得家蠶細胞及絲腺凋亡的分子調控機制研究更為完善，主要研究內容和結果如下:
　　1)克隆到了BmDredd基因，并且對其生物學信息進行了分析，其ORF全長1632bp，編碼

3、543個氨基酸，分子量大小約為63KDa，含有N端的long prodomain和C端的CASc domain。
　　2)在細胞水平進行BmDredd的功能研究:對BmN細胞進行了誘導凋亡、dsRNA干擾處理。我們發(fā)現(xiàn)凋亡的細胞中BmDredd表達量升高，而RNA干擾BmDredd的表達則可以減小細胞凋亡率，提高正常細胞數(shù)量。另外，我們構建了BmDredd的N端、C端融合表達載體以及ORF序列過表達載體，結果發(fā)現(xiàn)過表達BmDred

4、d可以引起細胞凋亡，細胞凋亡時，BmDredd由細胞質遷移到細胞核中，其核定位片段既不是獨立的N端long prodomain序列，也不是C端CASc序列，推測定位序列位于376-987bp之間。dsRNA干擾凋亡相關基因后實時定量檢測其他基因表達量結果顯示，BmDredd與BmDaxx，BmCide-b，BmFadd,BmCreb之間存在著復雜的調控關系，他們一起參與調控細胞凋亡的執(zhí)行。
　　3)絲腺水平的BmDredd功能研究

5、:我們檢測了不同時期家蠶絲腺中BmDredd表達量以及家蠶不同組織在吐絲18h時BmDredd表達量，發(fā)現(xiàn)絲腺凋亡期間，BmDredd表達量升高，表明BmDredd與絲腺凋亡有著極重要的聯(lián)系。并且，在蛻皮激素飼喂家蠶后，BmDredd表達量升高，說明BmDredd屬于蛻皮激素下游靶基因。Caspase抑制劑處理絲腺可以降低BmDredd表達量，注射dsRNA-BmDredd到家蠶絲腺可以延遲絲腺凋亡，在絲腺中過表達BmDredd引起過表

6、達部位caspase-3活性的升高，所有結果都顯示BmDredd參與和誘導絲腺凋亡。
　　4)Fadd屬于Fas結合蛋白，在哺乳動物中可以與procaspase-8結合形成DISC(Death-inducing signalling complex)，引起細胞死亡。本實驗我們純化到了含GST標簽的BmFadd蛋白，通過與凋亡細胞胞質總蛋白孵育，清洗和洗脫后質譜檢測，發(fā)現(xiàn)凋亡時BmFadd并沒有與BmDredd蛋白發(fā)生互作。

7、　　5)使用二代測序技術發(fā)現(xiàn)被歸到Death相關功能下的mRNAs在表達量上都沒有顯示出顯著性變化，這從側面反應了lncRNA和miRNA在絲腺凋亡發(fā)生期間對mRNA的調節(jié)可能十分重要。共鑒定到家蠶中10947個lncRNAs，預測到索引號為TCONS_00023629、TCONS_35829、TCONS_28940、TCONS_28943、TCONS_30941的lncRNAs參與了凋亡過程。另外有344個miRNAs靶向調節(jié)著285