IRE1α-XBP-1介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與胰島β細(xì)胞糖毒性的研究.pdf

1、目的:糖毒性是引起2型糖尿病患者胰島細(xì)胞功能衰竭的重要原因，其機(jī)制目前尚不明了。在胰島β細(xì)胞內(nèi)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是胰島素生物合成及新合成胰島素原折疊加工的重要場(chǎng)所。有研究提示短暫暴露于高糖常伴隨IRE1α的磷酸化，活化的IRE1α信號(hào)通路對(duì)胰島β細(xì)胞有保護(hù)作用。而對(duì)于糖尿病而言，胰島β細(xì)胞并非短暫而是長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境下，所以本研究擬通過(guò)小鼠胰島細(xì)胞株和大鼠原代胰島體外觀察IRE1α信號(hào)通路介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與持續(xù)暴露于高糖的胰島β細(xì)胞功能之間的關(guān)系

2、。在此基礎(chǔ)上，建立高脂喂養(yǎng)的肥胖動(dòng)物模型，觀察肥胖大鼠胰島在持續(xù)性高糖條件下是否更容易產(chǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在其中的作用和可能機(jī)制。 材料與方法: 1）將不同濃度葡萄糖（5.6、25和33.3 mmol/L組）分別加入胰島β細(xì)胞株MIN6培養(yǎng)液中，于不同時(shí)間點(diǎn)（24 h和96 h）收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力；ELISA法檢測(cè)胰島素和胰島素原分泌能力；Real-time PCR和Western

3、 blotting分別檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子Total XBP-1、Spliced XBP-1 mRNA及磷酸化IRE1α蛋白表達(dá)。 2）原位灌注法分離胰島，將不同濃度葡萄糖（5.6、25 mmol/L組）分別加入大鼠原代胰島培養(yǎng)液中，培養(yǎng)不同時(shí)間（24 h和96 h）后收集胰島進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。 3）建立高脂誘導(dǎo)肥胖大鼠模型，原位灌注分離胰島，置于含25mmol/L葡萄糖的培液中孵育24h和96h，利用Real time

4、PCR和免疫印記技術(shù)檢驗(yàn)肥胖大鼠胰島內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)分子mRNA及蛋白表達(dá)。 結(jié)果: 1）加入葡萄糖后96 h，各組細(xì)胞增殖活力均顯著低于孵育后24 h；在同一時(shí)間點(diǎn)，33.3和25 mmol/L組顯著低于5.6 mmol/L組。加入葡萄糖后96 h，33.3 mmol/L組胰島素分泌較干預(yù)后24 h明顯減少，而胰島素原分泌顯著增加。加入葡萄糖后24 h和96 h的各組Spliced XBP-1 mRNA表達(dá)，以及加入葡萄糖后

5、96 h的各組Total XBP-1 mRNA和磷酸化XBP- IRE1α蛋白表達(dá)，均隨葡萄糖濃度的增加而上調(diào)，呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。 2) 25mmol/L葡萄糖組經(jīng)96h孵育后，葡萄糖刺激的胰島素分泌能力較24h組明顯下降，胰島素原的分泌較24h有顯著增加。25mmol/L葡萄糖組孵育96小時(shí)后，BIP、Sliped-XBP-1 mRNA 表達(dá)較24小時(shí)顯著減少，CHOP mRNA表達(dá)則較24小時(shí)明顯增加，且較5.6mmol/L組

6、亦顯著增加。孵育24小時(shí)，5.6、25mmol/L葡萄糖組均可磷酸化IRE1α，但96小時(shí)后5.6mmolL組的磷酸化IRE1α減弱，25mmol/L組的磷酸化IRE1α則完全消失。 3）孵育96小時(shí)后HF組胰島中CHOP mRNA表達(dá)較CON組明顯升高，Spliced XBP-1、Total XBP-1無(wú)明顯差異。兩組胰島孵育24小時(shí)后均可見(jiàn)磷酸化的IRE1α，96小時(shí)則明顯減弱。 結(jié)論:持續(xù)性高糖可使胰島β細(xì)胞的增殖