VEGF對人肝癌細胞體外形成血管生成擬態(tài)能力的影響.pdf

1、研究目的:
　　通過外源加入不同濃度VEGF-A(vascular endothelial growth factor A)和內(nèi)源轉(zhuǎn)染VEGF-A質(zhì)粒兩個方面研究VEGF對人肝癌PLC細胞遷移、侵襲及體外形成血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)能力的影響。
　　方法:
　　1.選取人肝癌細胞系PLC，37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。實驗分為：正常對照組和加入不同濃度(10μg/L、30μ

2、g/L、60μg/L、100μg/L)VEGF-A組;
　　2.利用劃痕實驗觀察加入不同濃度VEGF-A誘導人肝癌PLC細胞后，細胞遷移能力的變化；
　　3.利用Transwell侵襲實驗觀察加入不同濃度VEGF-A誘導人肝癌PLC細胞后，細胞侵襲能力的變化；
　　4.明膠酶譜實驗檢測加入不同濃度VEGF-A后人肝癌PLC細胞基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質(zhì)金屬

3、蛋白酶9(Matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)活性的變化；
　　5.三維培養(yǎng)觀察加入不同濃度VEGF-A后各組肝癌細胞體外形成三維管道能力的變化；
　　6.Western blot檢測加入不同濃度VEGF-A后人肝癌PLC細胞內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)表達的變化；
　　7.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse trans

4、cription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測加入不同濃度VEGF-A后人肝癌PLC細胞VE-cadherin mRNA表達水平的變化；
　　8.瞬時轉(zhuǎn)染VEGF質(zhì)粒進入人肝癌PLC細胞，Western blot驗證轉(zhuǎn)染效果；
　　9.劃痕實驗觀察轉(zhuǎn)染VEGF后人肝癌PLC細胞遷移能力的變化；
　　10.Transwell實驗觀察轉(zhuǎn)染VEGF后人肝癌PLC細胞侵襲能力的變化；<

5、br>　　11.明膠酶譜實驗觀察轉(zhuǎn)染VEGF后人肝癌PLC細胞基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9表達活性的變化；
　　12.三維培養(yǎng)觀察轉(zhuǎn)染VEGF后人肝癌PLC細胞體外形成三維管道能力的變化；
　　13.Western blot檢測轉(zhuǎn)染VEGF后人肝癌PLC細胞VE-cadherin表達的變化；
　　14.RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染VEGF后人肝癌PLC細胞VE-cadherin mRNA表達的變化。
　　結(jié)果:<

6、br>　　1.遷移實驗結(jié)果顯示，加入不同濃度VEGF-A后人肝癌PLC細胞向劃痕中央遷移的距離明顯大于正常對照組(P<0.05)，并呈劑量依賴性；
　　2.Transwell實驗結(jié)果顯示，加入不同濃度VEGF-A組的PLC細胞穿膜數(shù)明顯多于正常對照組(P<0.05)；
　　3.明膠酶譜實驗結(jié)果顯示，加入不同濃度VEGF-A后人肝癌PLC細胞基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9表達活性增強(P<0.05)，并呈劑量依賴性；

7、r>　　4.三維培養(yǎng)結(jié)果顯示，加入不同濃度VEGF-A后人肝癌PLC細胞形成管道能力明顯增強，VEGF-A的濃度與管道數(shù)量之間呈顯著正相關(guān)(r=0.929)；
　　5.Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示加入不同濃度VEGF-A后人肝癌PLC細胞的VE-cadherin表達均增強(P<0.05)；
　　6.Western blot驗證轉(zhuǎn)染VEGF質(zhì)粒后的人肝癌PLC細胞VEGF蛋白的表達明顯上調(diào)(P<0.05)；<

8、br>　　7.轉(zhuǎn)染VEGF后，肝癌PLC細胞向劃痕中央遷移的距離明顯大于正常對照組(P<0.05)：
　　8.Transwell結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染VEGF組的PLC細胞穿膜數(shù)明顯多于正常對照組(P<0.05)：
　　9.轉(zhuǎn)染VEGF質(zhì)粒后，明膠酶譜實驗檢測肝癌PLC細胞表達基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的活性增強(P<0.05)；
　　10.三維培養(yǎng)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染VEGF后，肝癌PLC細胞能形成明顯的三維管道，而未轉(zhuǎn)染

9、組沒有管道形成；
　　11.Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染VEGF后PLC細胞VE-cadherin的表達明顯增強(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　VEGF能增強人肝癌PLC細胞的遷移、侵襲能力和VM形成能力，VEGF是肝癌VM形成中的重要調(diào)控分子，其機制可能是通過上調(diào)MMPs和VE-cadherin促進肝癌VM的形成，使腫瘤組織形成多樣化的局部微循環(huán)，促進腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移。本實驗為肝癌的抗血管治療