牛新孢子蟲(chóng)與牛瑟氏泰勒蟲(chóng)多重PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、牛瑟氏泰勒蟲(chóng)病是由泰勒科、泰勒屬的瑟氏泰勒蟲(chóng)(Theileria sergenti)寄生于牛體內(nèi)引起的一種血液原蟲(chóng)病。牛新孢子蟲(chóng)病(Neosporosis)是由犬新孢子蟲(chóng)(Neospora Caninum)或類新孢子蟲(chóng)(Neosporalike)寄生于牛體內(nèi)所引起的一種原蟲(chóng)病。 本研究首先利用DNASIS軟件分別對(duì)Kawazu等根據(jù)瑟氏泰勒蟲(chóng)P33表面蛋白基因序列設(shè)計(jì)的引物和GenBank登錄的犬新孢子蟲(chóng)種屬特異性基因片段Nc-

2、5序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行二聚體化、同源性和互補(bǔ)性分析，以避免引物之間形成穩(wěn)定的引物二聚體和避免具有較高的同源性和互補(bǔ)性。同時(shí)在已建立的牛瑟氏泰勒蟲(chóng)和牛新孢子蟲(chóng)常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，優(yōu)化引物濃度，Mgcl<,2>濃度，dNTP濃度，循環(huán)次數(shù)等反應(yīng)條件后，建立了檢測(cè)牛瑟氏泰勒蟲(chóng)和牛新孢子蟲(chóng)的多重PCR。 本體系特異擴(kuò)增片段理論大小分別為：瑟氏泰勒蟲(chóng)864bp，新孢子蟲(chóng)338bp。體系優(yōu)化的結(jié)果為：最佳引物濃度瑟氏泰勒蟲(chóng)為0.2pmol/m

3、L，新孢子蟲(chóng)0.2pmol/mL；dNTP最佳濃度為1.6mmol/L；多重PCR的最佳反應(yīng)模式為94℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃1min的循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)，然后經(jīng)72℃10min延伸，最后4℃7min結(jié)束PCR擴(kuò)增。用優(yōu)化后的PCR擴(kuò)增體系擴(kuò)增出與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的864bp和338bp特異性電泳帶。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該多重PCR可以檢測(cè)到16fg/mL瑟氏泰勒蟲(chóng)和18pg/mL新孢子蟲(chóng)的核酸模板；用感染牛附紅細(xì)胞體

4、的抗凝血、牛新孢子蟲(chóng)蟲(chóng)體、感染牛瑟氏泰勒蟲(chóng)的抗凝血、剛地弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體、牛魏氏梭菌、牛副結(jié)核桿菌、牛大腸桿菌的DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，以確定該多重PCR的特異性，結(jié)果新孢子蟲(chóng)和瑟氏泰勒蟲(chóng)均擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)的大小一致的核酸片段；而對(duì)照的病原體未擴(kuò)增出任何核酸片段；將用常規(guī)PCR檢測(cè)呈新孢子蟲(chóng)陽(yáng)性牛的病料和常規(guī)PCR檢測(cè)呈瑟氏泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性牛的抗凝血進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，結(jié)果多重PCR的檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)PCR的檢測(cè)結(jié)果符合率為100％。以上結(jié)果說(shuō)明本