曲安奈德對視網(wǎng)膜新生血管抑制作用的體內外實驗研究.pdf

1、第一部分研究曲安奈德在增生性視網(wǎng)膜病變中不同時期給藥的治療效果及其與血管內皮生長因子的相互作用機制。 第二部分觀察曲安奈德對正常和缺氧條件下體外培養(yǎng)恒河猴脈絡膜視網(wǎng)膜內皮細胞(RF/6A)增殖的抑制作用。 第三部分研究曲安奈德對缺氧條件下恒河猴脈絡膜視網(wǎng)膜內皮細胞VEGF表達的影響，探討曲安奈德治療視網(wǎng)膜脈絡膜新生血管的作用機理。 方法： 第一部分研究曲安奈德在增生性視網(wǎng)膜病變中不同時期給藥的治療效果及其

2、與血管內皮生長因子的相互作用機制。分組：將鼠齡為7d、健康的C57BL/6J幼鼠80只160眼隨機分成4組：預先治療組[進氧箱前(出生7d)治療組](n=20)，晚治療組[出氧箱后(出生12d)治療組](n=20)，正常對照組(n=20)，給氧對照組(n=20)。建立氧誘導的血管增生性視網(wǎng)膜病變幼鼠模型。 動物模型制作：正常對照組幼鼠與哺乳母鼠一起在正常空氣環(huán)境下飼養(yǎng)，預先治療組、晚治療組及給氧組幼鼠與哺乳母鼠一起置于密閉容器內

3、，氧氣的流量控制在1.50～2.50L/min，用CY-100型數(shù)字測氧儀(浙江省建德市利達儀器廠)監(jiān)測容器內的氧分壓4次/d，使容器內氧體積分數(shù)為75％±2％，在此高氧環(huán)境中飼養(yǎng)5d后(生后第12d)將幼鼠取出，回到正?？諝猸h(huán)境下飼養(yǎng)。預先治療組于進氧箱前(出生7d)，晚治療組于出氧箱后(出生12d)幼鼠玻璃體腔內分別注射曲安奈德1μl(0.04mg)，對側眼注射相同體積的平衡鹽溶液(balancedsaltsolution，BSS)

4、作為對照。應用熒光素灌注熒光血管造影法，了解視網(wǎng)膜血管改變；取幼鼠眼球作普通病理切片及免疫組化檢測，分別檢測視網(wǎng)膜新生血管芽內皮細胞數(shù)目及VEGF的表達。 第二部分觀察曲安奈德對正常和缺氧條件下體外培養(yǎng)恒河猴脈絡膜視網(wǎng)膜內皮細胞增殖的抑制作用。藥物劑量和分組：①正常對照組②正常低劑量組③正常中劑量組④正常高劑量組。⑤缺氧對照組⑥缺氧低劑量組⑦缺氧中劑量組⑧缺氧高劑量組。 缺氧模型建立參考kuwabara等介紹的方法加以改

5、進。將一干燥罐，除去蓋子中央原來的玻璃塞換上橡膠塞，橡膠塞鉆孔2個，一孔進氣，另一孔出氣。盛有細胞的6孔板置入干燥罐中，凡士林將蓋密封，在37℃下用輸氧管通入95％N2和5％CO2混合氣體，另一孔出氣，混合氣體以2-3L/min通入，用CY-100型數(shù)字測氧儀(浙江省建德市利達儀器廠)監(jiān)測出氣口的氧分壓1次/30分，使氧濃度小于1％，并用止血鉗夾住進、出氣管進行密閉，然后放入37℃孵箱繼續(xù)孵4小時。正常對照組為未加藥的正常生長的RF/6

6、A細胞，缺氧對照組為未加藥的缺氧條件生長的RF/6A細胞，正常和缺氧低、中、高劑量組曲安奈德含量分別為0.05mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml。將曲安奈德加入到培養(yǎng)的恒河猴脈絡膜視網(wǎng)膜內皮細胞(RF/6A)中，用MTT法測定曲安奈德對RF/6A細胞活性的影響，應用流式細胞儀觀察曲安奈德對正常和缺氧條件下細胞增殖與凋亡的影響。 第三部分研究曲安奈德對缺氧條件下恒河猴脈絡膜視網(wǎng)膜內皮細胞VEGF表達的影響。藥物劑量和分組：

7、①正常對照組②正常加藥組③缺氧對照組④缺氧加藥組，正常對照組為未加藥的正常生長的RF/6A細胞，缺氧對照組為未加藥的缺氧條件生長的RF/6A細胞，正常和缺氧加藥組曲安奈德含量均為1mg/ml。將曲安奈德加入到培養(yǎng)的恒河猴脈絡膜視網(wǎng)膜內皮細胞(RF/6A)中，分別采用免疫組化圖像分析和半定量RT-PCR方法，檢測曲安奈德對正常和缺氧條件下RF/6A細胞VEGF表達的影響。 結果： 第一部分視網(wǎng)膜新生血管芽內皮細胞核數(shù)目及V

8、EGF的OD總值表明：正常對照組(細胞核數(shù)目0.04±0.19；OD總值36.15±3.11)，預先治療組(細胞核數(shù)目7.82±1.15；OD總值86.36±2.89)，給氧對照組(細胞核數(shù)目23.57±1.95；OD總值212.35±5.93)和晚治療組(細胞核數(shù)目17.55±1.75；OD總值132.29±6.38)；預先治療組與給氧對照組和晚治療組相比，預先治療組和晚治療組分別與它們的對照眼及給氧對照組相比均有顯著意義；P＜0.0

9、1。 第二部分缺氧條件下可使內皮細胞周期中S期細胞相對減少，G2-M期細胞比例增加，曲安奈德對恒河猴脈絡膜視網(wǎng)膜內皮細胞周期有明顯影響并可誘導內皮細胞凋亡，可使正常及缺氧條件下內皮細胞周期中S期細胞相對增加，G2-M期細胞比例減少，說明曲安奈德可阻滯內皮細胞由S期進入G2-M期，從而降低其有絲分裂能力。 第三部分免疫組化顯示缺氧條件下VEGF蛋白在細胞胞漿中的染色強度明顯增強，加入曲安奈德后VEGF蛋白在細胞胞漿中的染色

10、強度明顯減弱，正常條件下的VEGF蛋白的OD值為276.82±8.63；正常加藥組的OD值為137.08±10.18；缺氧條件下的OD值為406.09±8.82；缺氧加藥組的OD值244.15±12.77。半定量RT-PCR表明VEGFmRNA在正常對照組RF/6A細胞中的相對表達量為1.38±0.05；缺氧對照組RF/6A細胞中的相對表達量為5.41±0.06；正常加藥組RF/6A細胞中的相對表達量為0.70±0.06；缺氧加藥組RF

11、/6A細胞中的相對表達量為4.23±0.05，以上兩種方法，缺氧對照組與正常對照組比較、缺氧對照組與缺氧加藥組比較、正常對照組與正常加藥組比較差異均有顯著性意義(P=0.000)。 結論： 病變早期應用曲安奈德可預防視網(wǎng)膜新生血管的形成；缺氧條件可促進視網(wǎng)膜內皮細胞的增殖及RF/6A細胞中VEGF的表達明顯增高；曲安奈德可以抑制視網(wǎng)膜新生血管形成和VEGF的表達；曲安奈德抑制RF/6A增殖的作用機理，與通過影響細胞周期，