頭孢曲松改善血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶功能及其機(jī)制.pdf

1、背景和目的：血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)嚴(yán)重影響患者的身心健康和生存質(zhì)量。谷氨酸是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，發(fā)揮重要的生理作用。但過量的谷氨酸對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有興奮性毒性作用，可導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，是引發(fā)VD的重要機(jī)制之一。膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1（glial glutamate transporter GLT-1）在終止谷氨酸能神經(jīng)傳遞、維持細(xì)胞外液谷氨酸濃度處于低水平、防止其興奮性毒性作用方面發(fā)揮

2、重要的作用。通過調(diào)制GLT-1、增強(qiáng)其攝取細(xì)胞外液谷氨酸的能力有可能成為治療血管性癡呆的新思路。
　　 β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢曲松(Ceftriaxone，Cef)可以特異性的上調(diào)GLT-1的表達(dá)及其對(duì)谷氨酸的攝取，降低細(xì)胞外液中谷氨酸濃度及其興奮性毒性作用，從而發(fā)揮抗局灶性及全腦缺血性腦損傷作用、以及抗神經(jīng)病理性痛和痛過敏作用。據(jù)此，我們推測Cef可能會(huì)具有抗VD的作用。為證實(shí)這一設(shè)想，本研究觀察Cef對(duì)VD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、

3、海馬神經(jīng)元存活狀態(tài)、以及GLT-1表達(dá)的變化，探討Cef在預(yù)防和治療VD中的作用、和GLT-1在VD發(fā)生發(fā)展中的作用，為臨床上預(yù)防和治療VD提供新線索和依據(jù)。
　　 方法：健康雄性老齡（9-10月齡）C57BL/6小鼠70只，體重30±5克，隨機(jī)分為以下5組:
　　 正常對(duì)照組(n=10):正常動(dòng)物，不作任何處理，直接測定其學(xué)習(xí)記憶能力、觀察海馬組織學(xué)改變和GLT-1的表達(dá)。
　　 Sham組(n=10):給動(dòng)物

4、進(jìn)行VD的sham手術(shù)，于術(shù)后29天測定其學(xué)習(xí)記憶能力、觀察海馬組織學(xué)改變和GLT-1的表達(dá)。
　　 VD模型組(n=10):給動(dòng)物進(jìn)行VD造模手術(shù)，其它同sham組。
　　 Cef預(yù)防(Cefprevention)組(n=20):首先給動(dòng)物腹腔注射Cef(200mg/kg)，每日1次，連續(xù)7天。末次注射后1天給動(dòng)物進(jìn)行VD造模手術(shù)。其它同sham組。同時(shí)設(shè)NS對(duì)照組(n=10)。
　　 Cef治療（Cefthe

5、rapy）組(n=20):首先給動(dòng)物進(jìn)行VD造模手術(shù)。于手術(shù)后第二天開始腹腔注射Cef(200mg/kg)，每日1次，連續(xù)7天。其它同sham組。同時(shí)設(shè)NS對(duì)照組(n=10)。
　　 以重復(fù)阻斷小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流法制作VD模型，每次阻斷20min，間隔10min，重復(fù)3次。采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測定動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。應(yīng)用硫堇染色法觀察動(dòng)物海馬組織學(xué)變化，依據(jù)Kitagawa和Kato的分級(jí)方法(Histologicalg

6、rade，HG)對(duì)海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回(dentategyrusDG)區(qū)進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)價(jià)，標(biāo)準(zhǔn)如下:0級(jí)，無神經(jīng)元死亡;Ⅰ級(jí)，散在神經(jīng)元死亡;Ⅱ級(jí)，成片神經(jīng)元死亡;Ⅲ級(jí)幾乎全部神經(jīng)元死亡。應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察海馬GLT-1的表達(dá)情況。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用單因素方差分析(One-WayANOVA)、重復(fù)測量分析（Repeated-Measures法）和秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis法）進(jìn)行數(shù)據(jù)

7、分析，以P＜0.05作為判斷差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1、水迷宮實(shí)驗(yàn)
　　 隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，正常對(duì)照組動(dòng)物的尋臺(tái)潛伏期逐漸縮短，第十次訓(xùn)練時(shí)縮短為25.7±13.1(sec)。Sham組動(dòng)物的尋臺(tái)潛伏期的變化趨勢與正常對(duì)照組相比無明顯差別(P＞0.05)。VD模型組動(dòng)物的尋臺(tái)潛伏期較Sham組和正常對(duì)照組顯著延長(P＜0.05)。Cef預(yù)防組動(dòng)物的尋臺(tái)潛伏期較VD模型組明顯縮短(P＜0.05)，

8、接近sham組。治療組動(dòng)物的尋臺(tái)潛伏期與VD模型組相比無明顯差異(P＞0.05)。
　　 空間記憶保持能力測定顯示，正常對(duì)照組和Sham組動(dòng)物在目標(biāo)象限滯留時(shí)間比例無明顯差別(P＞0.05)。VD模型組動(dòng)物較正常對(duì)照組和Sham組動(dòng)物顯著縮短(P＜0.05)。Cef預(yù)防組動(dòng)物在目標(biāo)象限的滯留時(shí)間較VD模型組動(dòng)物顯著升高(P＜0.05)，接近sham組水平。治療組動(dòng)物在目標(biāo)象限的滯留時(shí)間與VD模型組相比無明顯差異(P＞0.05)。

9、
　　 2、海馬組織病理學(xué)評(píng)價(jià)
　　 正常對(duì)照組動(dòng)物海馬CA1區(qū)輪廓清晰，錐體細(xì)胞為3-5層，細(xì)胞排列規(guī)則緊密，形狀呈圓形或橢圓形，組織學(xué)分級(jí)(Histologicalgrade，HG)以0-Ⅰ級(jí)為主，0級(jí)動(dòng)物占90％。Sham組動(dòng)物海馬組織病理學(xué)改變與正常對(duì)照組動(dòng)物類似。VD模型組動(dòng)物海馬錐體細(xì)胞層數(shù)減少，排列松散，細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，有核固縮現(xiàn)象，部分區(qū)域出現(xiàn)神經(jīng)元大面積缺失，僅有少量細(xì)胞存活;與正常對(duì)照和

10、Sham組相比，其HG顯著升高（P＜0.05），表現(xiàn)為0級(jí)動(dòng)物比例降低至20％，Ⅰ級(jí)動(dòng)物升至40％，并且出現(xiàn)2級(jí)和3級(jí)動(dòng)物，比例均達(dá)到20％。Cef預(yù)防組小鼠海馬錐體細(xì)胞排列較整齊，層次較清晰，細(xì)胞形態(tài)基本正常，無明顯核固縮現(xiàn)象發(fā)生;與VD模型組相比，其HG顯著下降(P＜0.05)，表現(xiàn)為0級(jí)比例升高，達(dá)到70％，其余30％的動(dòng)物為Ⅰ級(jí)，無Ⅱ和Ⅲ級(jí)動(dòng)物。與VD模型組相比，Cef治療組海馬CA1區(qū)組織學(xué)特征無明顯變化。
　　 海馬

11、CA3區(qū)和齒狀回的組織病理學(xué)變化趨勢與海馬CA1區(qū)相類似。
　　 3、GLT-1表達(dá)
　　 在正常對(duì)照組和Sham組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元層及其周邊區(qū)域均可見棕黃色GLT-1的免疫反應(yīng)顆粒，染色均勻。VD模型組GLT-1免疫反應(yīng)性顯著下降，染色較淺，積分光密度值明顯降低，表明缺血再灌注損傷下調(diào)了GLT-1的表達(dá)。與VD模型組相比，Cef預(yù)防組GLT-1的免疫反應(yīng)性顯著增強(qiáng)，染色加深，積分光密度值較VD模型組有顯著升高(P

12、＜0.05)，表明Cef可以上調(diào)GLT-1的表達(dá)，并抑制缺血-再灌注損傷引起的GLT-1表達(dá)的下降。Cef治療組GLT-1的免疫反應(yīng)性亦顯著增強(qiáng)，染色加深，積分光密度值較VD模型組有顯著升高(P＜0.05)，但升高幅度低于Cef預(yù)防組。生理鹽水對(duì)照組GLT-1的表達(dá)同VD模型組相比無明顯變化。
　　 海馬CA3區(qū)和齒狀回GLT-1表達(dá)的變化趨勢與CA1區(qū)相類似。
　　 結(jié)論:
　　 1、多次結(jié)扎松開雙側(cè)頸總動(dòng)脈致

13、大腦缺血-再灌注的方法可使老齡C57BL/6小鼠空間學(xué)習(xí)獲得能力和空間記憶保持能力顯著下降，此方法可以作為VD動(dòng)物模型的制作方法。
　　 2、VD模型組小鼠海馬各區(qū)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元死亡和GLT-1表達(dá)下調(diào)。這些變化可能是導(dǎo)致其學(xué)習(xí)記憶能力下降的原因。
　　 3、預(yù)防性應(yīng)用Cef可以減輕缺血-再灌注引起的認(rèn)知障礙、海馬各區(qū)神經(jīng)元死亡和GLT-1表達(dá)下降。
　　 4、上述結(jié)果提示，Cef可通過上調(diào)GLT-1的表達(dá)減輕