生物活性肽的大分子修飾及活性研究.pdf

1、生物活性肽類藥物以具有高效、低毒等優(yōu)點倍受青睞，但因其體內穩(wěn)定性差、作用時間短而限制了其臨床應用。多肽類激素降鈣素（Calcitonin，CT），含有32個氨基酸殘基，從不同種屬動物中分離得到的天然降鈣素，雖然它們的氨基酸殘基有所差別，但是分子中都有一個二硫環(huán)，且肽鏈羧基末端都是脯氨酰胺基團。天然降鈣素中以魚類等脊椎動物的活性最強，哺乳類動物的降鈣素活性較弱。多種降鈣素的合成類似物，已在臨床應用多年，主要用于治療老年性骨質疏松、Page

2、t's癥、高血鈣癥、脊椎管狹窄癥、急性胰腺炎、胃潰瘍等。但是，天然降鈣素的半衰期短，在溶液中不穩(wěn)定，臨床應用中需頻繁注射給藥，造成患者用藥順應性差。為了增強其穩(wěn)定性、延長作用時間，本課題根據(jù)已有的構效關系研究結果，設計了一系列降鈣素類似物，并進行了大分子修飾，通過評價修飾產物的生物活性和代謝特征，以期獲得長效的降鈣素類似物。
　　 依據(jù)本課題組前期的研究結果及文獻調研情況，對降鈣素進一步的結構改造包括：1）由于二硫鍵不是降鈣活性

3、所必需的基團，且其在中性或堿性溶液中易開環(huán)，是不穩(wěn)定的主要原因，故將肽鏈氨基末端1和/或7位的Cys用Val或D/L-Ala替代，設計了不含二硫鍵的非環(huán)狀類似物；2）CT的10、28位Gly殘基是非手性的，分子柔性大，用分子結構中含有五元環(huán)而剛性較大的Pro或D-Pro替換，可改變天然肽鍵的構型，有利于增加肽的酶解穩(wěn)定性；3）文獻報道，19-22位氨基酸殘基的缺失對活性影響不大，據(jù)此可獲得較短的肽鏈；4）對易酶解位點Lys11以胍氨酸（

4、Cit）替換，增加其酶解穩(wěn)定性；5）大分子修飾是改善蛋白質類藥物生物活性、理化特性及藥代動力學特性的重要方法之一。經(jīng)大分子修飾的蛋白質和多肽類藥物，在保持其主要生物學功能不變的前提下，表現(xiàn)出藥物水溶性提高，毒副作用和免疫原性降低，體內穩(wěn)定性增強，熱穩(wěn)定性增強，水溶性增加.半衰期延長等優(yōu)點。用于修飾蛋白質類藥物的大分子包括聚乙二醇（PEG）、白蛋白、唾液酸和多糖等，其中PEG的應用最為廣泛。已有多種PEG修飾的蛋白質藥物被美國食品與藥品監(jiān)

5、督管理局（FDA）批準上市，成為獲得長效蛋白質類藥物的重要技術方法之一。經(jīng)PEG修飾的CT藥物，其在組織勻漿中的穩(wěn)定性增加的原因可能是大分子PEG能降低蛋白酶對CT的水解作用。據(jù)此，對CT類似物進行PEG修飾，達到提高其穩(wěn)定性延長藥物作用時間的目的。然而，多肽和蛋白質中通常含有多個可與PEG偶聯(lián)的反應基團，如CT的肽鏈氨基末端α-氨基和Lys11，18的ε-氨基，均可同時發(fā)生PEG化反應。由于反應選擇性的問題，往往易形成混合產物，這是造

6、成PEG修飾產物生物活性減小乃至喪失的重要因素。本課題將利用巰基的高反應活性，在肽鏈中保留一個Cys并選取能夠特異性與巰基偶聯(lián)的PEG修飾劑，獲得定點單PEG修飾產物。
　　 目的：對CT原型藥中某些位點氨基酸殘基進行替換，以期得到活性較好、生物穩(wěn)定性高的CT類似物，同時進一步探討CT的構效關系；另一方面，選擇活性較好的CT類似物進行PEG修飾，進一步做動物體內的代謝研究。
　　 方法：本課題中，肽類似物的合成應用固相多

7、肽合成法，以酰胺型MBHA和Rink Amide樹脂為固相載體，采用Fmoc/tBu正交保護策略，由肽鏈氨基端向羧基端延長肽鏈。肽樹脂以三氟醋酸（TFA）或無水氟化氮（HF）裂解。粗肽以反相高效液相色譜（RP-HPLC）進行純化及純度鑒定，以基質輔助激光離子化-飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）進行分子量和PEG修飾度的鑒定。所得化合物均進行降鈣活性評價。
　　 結果：根據(jù)上述設計思路和實驗方案，共合成了10個降鈣素類似物

8、及9個PEG修飾產物。降鈣素類似物的純度為87％～98％，合成收率為10％～22％。實測分子量與理論值一致，PEG修飾產物的M_ALDI-TOF-MS圖譜數(shù)據(jù)表明只有1個PEG分子偶聯(lián)到肽鏈上。
　　 結論：初步的生物活性測定表明，有4個化合物顯示了較好的降鈣活性，其中2個化合物的活性高于CT原型對照藥，但均比陽性對照模板化合物LK-YB低。依據(jù)活性測定結果和CT類似物的序列，對構效關系進行了初步探討：1）不含二硫環(huán)的CT類似物