過表達JHDM2A基因?qū)ωiiPSCs誘導(dǎo)效率影響的初步研究.pdf

1、iPS技術(shù)為構(gòu)建疾病模型、研制評估新藥、基因治療及再生醫(yī)學(xué)等研究奠定了基礎(chǔ)，是干細胞研究領(lǐng)域的里程碑。豬在生理及體型上與人相似，因此研究豬的iPS細胞意義重大。但目前豬成纖維細胞誘導(dǎo)為iPS的重編程效率不足1％。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白H3K9甲基化阻礙體細胞重編程，降低H3K9甲基化水平可促進iPS誘導(dǎo)。組蛋白甲基化水平受組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶與組蛋白去甲基化酶共同調(diào)節(jié)。JHDM2A，即JmjC結(jié)構(gòu)域組蛋白去甲基化酶2，可使H3K9me1/2發(fā)生去

2、甲基化。過表達JHDM2A基因可促進與ESCs融合的小鼠NSCs重編程為iPS，促進iPSCs誘導(dǎo);還可調(diào)節(jié)胚胎干細胞的自我更新。本研究首先采用DOX誘導(dǎo)型的慢病毒載體體系，誘導(dǎo)獲得豬多能干細胞（piPSCs），在此基礎(chǔ)上通過過表達JHDM2A基因，探究組蛋白H3K9me1/2甲基化水平對豬iPSCs誘導(dǎo)效率的影響，并對其分子機制進行初步探究，以便為進一步提高iPSCs誘導(dǎo)效率、建立大家畜ESCs系奠定基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下:

3、　　1、豬JHDM2A基因克隆及其表達載體構(gòu)建
　　根據(jù)NCBI上公布的豬JHDM2A基因序列，設(shè)計特異性擴增引物，克隆得到豬JHDM2A基因，其編碼區(qū)長度為3945 bp，編碼1315個氨基酸。多重氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，豬JHDM2A基因與黃牛、水牛、綿羊和人相應(yīng)氨基酸序列的同源性分別為93.5％、94.7％、94.7％、93.8％。蛋白質(zhì)分子系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，JHDM2A基因在物種進化過程中高度保守。免疫組化結(jié)果顯示，JH

4、DM2A蛋白在不同發(fā)育階段豬卵泡中均有表達。進一步構(gòu)建并驗證了pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表達載體。
　　2、過表達JHDM2A基因?qū)ωiiPSCs形成及相關(guān)基因表達的影響
　　首先利用DOX誘導(dǎo)型慢病毒載體體系，將OSKM因子組合導(dǎo)入豬成纖維細胞，將其誘導(dǎo)為iPSCs，在此基礎(chǔ)上過表達JHDM2A基因，并分別對獲得的iPSCs進行鑒定。
　　當(dāng)過表達JHDM2A基因時，細胞在第3d出現(xiàn)形變，第

5、8d形成piPSCs克隆，分別比未處理組提前了1d、2d。AP檢測陽性克隆數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未處理組相比，過表達JHDM2A基因?qū)嶒灲M的誘導(dǎo)效率提高了8倍，且iPSCs克隆大小更均勻、邊緣更整齊、細胞更致密，AP染色著色更深。RT-PCR分析結(jié)果顯示，所檢測的三種細胞均表達Klf4、c-Myc、Nanog多能性基因，弱表達Sox2基因;過表達JHDM2A實驗組和未處理組的piPSCs均表達Oct4，而PFF弱表達表達Oct4。定量PCR結(jié)果

6、顯示,與未處理組相比，過表達JHDM2A實驗組piPSCs多能性基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog表達顯著升高(P＜0.05)，其中對Oct4的表達影響極顯著(P＜0.01)。去DOX后，過表達JHDM2A實驗組細胞中的外源基因沉默，內(nèi)源性O(shè)ct4基因表達逐代幾乎沒有變化，Sox2、Nanog基因表達逐代降低，Klf4、c-Myc基因表達先升高后降低。與未處理組和PFF相比，過表達JHDM2A實驗組piPSC組蛋白