氯化鎘對大鼠胰島瘤INS-1細(xì)胞自噬和凋亡的影響.pdf

1、背景：
　　 當(dāng)前心血管疾病、癌癥和糖尿病已成為導(dǎo)致人類死亡的前三位死亡原因。其中環(huán)境污染為糖尿病發(fā)病的重要誘因。環(huán)境污染近年來日趨嚴(yán)重，同時糖尿病的發(fā)病率也逐年增加，而鎘在重金屬環(huán)境污染物中很常見并具有代表性。目前評估鎘對健康的影響及建立作用于不同器官系統(tǒng)的濃度-反應(yīng)模型的研究較多，如鎘與癌癥、腎臟和肝臟損傷、骨質(zhì)疏松或軟化、生殖系統(tǒng)影響的研究較廣泛，而其與胰腺或糖尿病的研究甚少。與此同時，近年來自噬研究成為熱點，其在免疫、炎

2、癥、感染、腫瘤、衰老及心血管病、肝臟疾病、肌肉疾病、神經(jīng)退行變等領(lǐng)域的研究廣泛，目前已有研究證實自噬亦與糖尿病和胰島細(xì)胞相關(guān)，但研究較少，具體機(jī)制尚不清楚。自噬與糖尿病和胰島細(xì)胞的關(guān)系及調(diào)控機(jī)制的研究可對開發(fā)臨床治療相關(guān)藥物和為糖尿病及其并發(fā)癥的防治提供新的思路有重要意義。本課題用不同濃度的氯化鎘(CdCl2)干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠胰島瘤細(xì)胞INS-1，并通過各種實驗室方法檢測其凋亡及自噬情況，從整體上研究氯化鎘對胰島細(xì)胞自噬、凋亡的影響，

3、可為揭示鎘對胰島功能的損傷機(jī)理提供新的證據(jù)，而有關(guān)分子機(jī)制的揭示也可為修復(fù)胰島損傷尋找新的治療靶點。
　　 目的：
　　 研究典型持久性有毒污染物CdCl2對大鼠胰島瘤INS-1細(xì)胞自噬和凋亡的影響及二者的關(guān)系，同時探索可能的分子機(jī)制和參與因素。
　　 方法：
　　 取處于對數(shù)期的INS-1細(xì)胞用于實驗，分別用0、0.01、0.1、1μmol/L CdCl2處理細(xì)胞，48h后用Hochest染色法在顯微鏡

4、下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，用磺酰羅丹明B（SRB）染色法檢測CdCl2對INS-1細(xì)胞增殖的影響;用2'，7'-二氯熒光素二乙酸鹽(DCFH-DA)作為熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的水平變化;應(yīng)用Western blot檢測細(xì)胞自噬體膜上自噬標(biāo)志分子-微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、凋亡標(biāo)志蛋白-聚腺苷二磷酸核糖多聚酶(PARP)的切割帶變化及檢測（哺乳動物）雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路的70 KD的磷酸化的核糖體S6激酶(

5、p70)、p70的磷酸化形式p-p70的變化，以明確CdCl2是否可誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞產(chǎn)生自噬及其是否通過mTOR依賴的信號通路;將INS-1細(xì)胞的自噬必需基因7(Atg7)通過siRNA介導(dǎo)的RNA干擾手段進(jìn)行沉默，然后以1μmol/L CdCl2處理細(xì)胞，48h后應(yīng)用Western blot檢測細(xì)胞中Atg7、LC3-Ⅱ、PARP切割帶，以確定CdCl2所誘導(dǎo)的自噬對INS-1細(xì)胞凋亡的影響;先用400μmol/L的活性氧清除劑N

6、-乙酰半胱氨酸(NAC)處理INS-1細(xì)胞，1h后加入1μmol/L CdCl2，48h后應(yīng)用SRB染色法探明NAC處理后對INS-1細(xì)胞增殖是否有保護(hù)作用，Western blot檢測LC3-Ⅱ蛋白、PARP切割蛋白，以確定CdCl2是否通過刺激活性氧的產(chǎn)生誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞的自噬和凋亡。
　　 結(jié)果：
　　 0.1、1μmol/L CdCl2干預(yù)24h后，細(xì)胞皺縮，變小變圓，凋亡增加，與對照組比較，存活率明顯降低(P

7、＜0.05);與對照組相比，各濃度組LC3-Ⅱ和PARP切割帶蛋白水平均增加，LC3-Ⅱ呈時間和劑量依賴性，PARP切割帶呈時間依賴性，p70、p-p70蛋白水平無明顯變化;與陰性對照組相比，Atg7 siRNA組Atg7蛋白水平顯著降低，與陰性對照+CdCl2組相比，Atg7 siRNA+CdCl2組LC3-Ⅱ蛋白水平明顯下降，而PARP切割帶蛋白水平變化則與之相反;與對照組相比，各濃度組活性氧產(chǎn)生均明顯增多，呈劑量依賴性;與CdCl