燒傷早期大鼠心肌線粒體比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、缺血缺氧是嚴(yán)重?zé)齻缙谥匾牟±砩憩F(xiàn)象，而缺血缺氧引發(fā)細(xì)胞死亡和組織器官損害的根本原因是能量代謝障礙。心臟是一高耗能的器官，線粒體正常的呼吸功能在維持心臟的正常生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。以往研究已證實(shí)，在嚴(yán)重?zé)齻蛐募∪毖毖鯐r(shí)，線粒體氧化磷酸化關(guān)鍵酶活性降低、ATP合成不足是誘發(fā)或加重心肌損傷的重要原因，而心臟作為全身血液循環(huán)的動(dòng)力器官，心肌的損傷和功能減退必將進(jìn)一步加重全身的缺血缺氧，從而形成惡性循環(huán)。 線粒體能量代謝障礙是

2、多種復(fù)雜因素共同作用的結(jié)果，尤其是當(dāng)機(jī)體受到燒傷、創(chuàng)傷、應(yīng)激、缺氧等刺激時(shí)。以往多研究關(guān)鍵酶在能量代謝障礙中的作用，對(duì)能量代謝障礙發(fā)生發(fā)展過程中線粒體的損傷與代償反應(yīng)缺乏整體了解，因此，缺少防治線粒體能量代謝障礙的有效干預(yù)手段。比較蛋白質(zhì)組學(xué)為我們提供了全貌性了解心肌線粒體在燒傷早期代謝障礙發(fā)生發(fā)展過程中蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)規(guī)律，以及在此基礎(chǔ)上探索上游分子機(jī)制或關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)的手段。 本研究利用大鼠燒傷模型，以比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法動(dòng)

3、態(tài)觀察燒傷早期心肌線粒體蛋白質(zhì)組的表達(dá)差異，并初步驗(yàn)證了關(guān)鍵的差異表達(dá)蛋白活性改變可能引起的生物效應(yīng)，有助于了解在應(yīng)激、缺氧等刺激下心肌線粒體的損傷與代償反應(yīng)，尋找在心肌線粒體能量代謝障礙的發(fā)生發(fā)展中起重要作用的關(guān)鍵蛋白分子，為防治燒傷早期心肌損傷提供新靶點(diǎn)與理論依據(jù)。 材料與方法： 采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法 1.以Nycodenz密度梯度離心法獲取大鼠心肌組織純化線粒體，并以透射電鏡、Westernb

4、lot法驗(yàn)證其純度與完整性； 2.建立大鼠30％TBSAⅢ°燙傷模型，以正常對(duì)照組與燒傷各組純化的心肌線粒體裂解蛋白行雙向凝膠電泳(2-DE)、考馬斯亮藍(lán)染色、凝膠掃描后獲2-DE圖譜，以PDQuest軟件分析各組差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，并將各蛋白點(diǎn)切下行膠內(nèi)酶解、質(zhì)譜分析后獲差異表達(dá)蛋白譜： 3.在動(dòng)物燒傷模型與體外細(xì)胞缺氧模型的基礎(chǔ)上，驗(yàn)證關(guān)鍵差異蛋白的表達(dá)趨勢(shì)，同時(shí)檢測(cè)以魚藤酮作用于心肌細(xì)胞驗(yàn)證關(guān)鍵蛋白活性受抑后的生物效應(yīng)

5、，以及心肌線粒體的超微病理損傷。 主要結(jié)果與結(jié)論： 1.采用Nycodenz不連續(xù)密度梯度離心法提純了大鼠心肌線粒體，并以透射電鏡與Westernblot法證實(shí)在不影響線粒體完整性的情況下，提純過程進(jìn)一步提高了線粒體的純度與富集程度： 2.以正常對(duì)照組與燒傷后1、3小時(shí)組的心肌線粒體蛋白行雙向電泳，得到聚焦良好、顯色清晰、相似性高的2-DE圖譜，在各組膠上平均有394.7±5.5、391.0±13.9、385.3

6、±12.6個(gè)蛋白點(diǎn)，以PDQuest軟件對(duì)各組圖譜分析后得到10個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，將各點(diǎn)行膠內(nèi)酶解、質(zhì)譜分析后獲得差異表達(dá)蛋白譜； 3.通過分析差異表達(dá)蛋白譜，發(fā)現(xiàn)其中8個(gè)蛋白在燒傷早期表達(dá)下降，分別為：TNF受體相關(guān)蛋白1、甲基丁烯酰輔酶A羧化酶1(α)、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白-泛醌氧化還原酶、NADP+依賴的蘋果酸酶3、NADH脫氫酶(泛醌)黃素蛋白1、線粒體翻譯延伸因子Tu(EF-Tumt)、長(zhǎng)鏈乙酰-輔酶A脫氫酶與短鏈乙酰-輔

7、酶A脫氫酶；體現(xiàn)了燒傷后的機(jī)體損傷，這些蛋白表達(dá)降低可能引起的生物效應(yīng)是ATP合成減少、ROS生成增多、抗氧化能力降低、促進(jìn)凋亡；另外2個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)增高，分別為：推測(cè)蛋白LOC498909與ATP合酶F1復(fù)合體α亞單位，其意義可能為抵抗上述各種損傷的內(nèi)源性保護(hù)效應(yīng)； 4.在表達(dá)下降的蛋白點(diǎn)中我們發(fā)現(xiàn)在功能上有密切關(guān)系的兩個(gè)蛋白點(diǎn)，即EF-Tumt與NADH脫氫酶。EF-Tumt為參與NADH脫氫酶蛋白合成的上游因子，而NADH脫

8、氫酶為線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的催化核心，其下降將引起復(fù)合體Ⅰ活性降低，因此，我們推測(cè)燒傷后EF-Tumt表達(dá)下降可能通過降低NADH脫氫酶的蛋白表達(dá)進(jìn)一步影響呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ活性，導(dǎo)致能量代謝障礙； 5.為初步證實(shí)這一推測(cè)，我們首先回復(fù)驗(yàn)證了EF-Tumt、NADH脫氫酶亞單位3在各組動(dòng)物心肌線粒體中的表達(dá)變化，證實(shí)了2-DE結(jié)果的可靠性；并發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的缺氧心肌細(xì)胞中EF-Tumt蛋白表達(dá)亦有降低；在體外以魚藤酮阻斷復(fù)合體Ⅰ的生物