凋亡相關(guān)蛋白PNAS-2參與白血病發(fā)病機制的研究.pdf

1、目的和意義：PNAS-2 是一種凋亡相關(guān)基因，本實驗室初步研究發(fā)現(xiàn)其可能參與白血病起病。我們試圖通過研究該蛋白在不同細胞中表達量和定位的差異及藥物處理前后兩者的變化以探尋PNAS-2蛋白參與白血病起病的機制。 實驗方法和結(jié)果： 第一部分，PNAS-2 單克隆抗體的制備和初步鑒定。根據(jù)PNAS-2 一級結(jié)構(gòu)推測二級結(jié)構(gòu)，選取符合條件的肽段作為抗原決定簇，化學(xué)合成后和BSA 偶聯(lián)；通過動物免疫，細胞融合，有限稀釋克隆化，腹水

2、擴增獲得敏感性高，特異性好的單克隆抗體及分泌穩(wěn)定的雜交瘤細胞株S-31-7。在Wstern蛋白定量研究及免疫熒光定位研究實驗中效果理想，可作為后續(xù)實驗的可靠工具。 第二部分，PNAS-2蛋白在細胞中表達和定位的研究。我們運用上述獲得的PNAS-2單抗檢測該蛋白在不同細胞中表達量和定位的差異。研究發(fā)現(xiàn)PNAS-2蛋白在白血病細胞株中表達量較人類非腫瘤細胞株高，在白血病初發(fā)患者的原代細胞中，其蛋白表達較緩解及非腫瘤患者高；且在白血病

3、細胞株及白血病初發(fā)、復(fù)發(fā)患者的原代細胞中，其定位與非腫瘤細胞株及非腫瘤患者原代細胞中的定位有明顯差異。 第三部分，PNAS-2蛋白抑制白血病細胞凋亡的機制研究。比較U937細胞株中抑制PNAS-2 表達的RNA 干擾組及對照組間凋亡相關(guān)蛋白表達差異，探討其抑制白血病細胞凋亡的機制。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，抑制PNAS-2蛋白表達后，細胞株中的GraB，AIF，P53，Rb，caspase3蛋白的表達量均明顯上升，說明抑

4、制PNAS-2蛋白的表達有促進細胞凋亡,抑制腫瘤生長的作用。且PNAS-2 通過AIF 介導(dǎo)的非caspase 依賴途徑及caspase 依賴途徑中的GraB-Perforin 通路抑制細胞凋亡。 第四部分，磷酸氯喹對白血病細胞的影響及與PNAS-2蛋白的關(guān)系。磷酸氯喹是一種生物膜穩(wěn)定藥物，我們發(fā)現(xiàn)其對白血病細胞株有誘導(dǎo)凋亡的作用，并且發(fā)現(xiàn)藥物處理后細胞內(nèi)PNAS-2的異常定位能夠被糾正，并且表達量也相應(yīng)減少。白血病患者的原代細

5、胞經(jīng)同樣處理，也可得到類似效果。本文推斷，PNAS-2是一種凋亡抑制蛋白，在白血病細胞中可能存在多泡體膜穩(wěn)定性下降的異?，F(xiàn)象，從而使得原本應(yīng)局限于MVB膜上的PNAS-2發(fā)生異常定位及過量表達，其抑制細胞凋亡的作用被放大，最終導(dǎo)致細胞的惡性增殖。 結(jié)論：PNAS-2蛋白在白血病細胞中存在異常定位和過量表達，其通過MVB途徑抑制了細胞凋亡而參與了白血病的起病。磷酸氯喹能夠增加MVB膜穩(wěn)定性，糾正PNAS-2蛋白的異常定位和過量表達