甘草甜素對大鼠心肌缺血再灌注后的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:甘草甜素通過抑制HMGB1對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　 背景:心肌缺血再灌注損傷指缺血心肌在恢復(fù)血流再灌注后，反而加重其結(jié)構(gòu)破壞，引起細(xì)胞死亡，導(dǎo)致梗死范圍擴(kuò)大，造成心功能的進(jìn)一步損害并影響心肌梗死患者的預(yù)后。心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，氧自由基、鈣超載、炎癥介質(zhì)是比較公認(rèn)的機(jī)制，其中炎癥反應(yīng)是造成心肌缺血再灌注損傷損傷的重要原因之一。如何揭示其發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及合理的干預(yù)以減少缺血再灌注后炎癥反應(yīng)是

2、目前研究的熱點(diǎn)，也是本課題研究的出發(fā)點(diǎn)。
　　 高遷移率族蛋白B1(high mobility group box protein1，HMGB1)是一種重要的“晚期”炎性細(xì)胞因子，HMGB1還可能是致炎細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個中心環(huán)節(jié)，炎癥反應(yīng)的晚期，HMGB1釋放增加，釋放入血的HMGB1通過內(nèi)分泌和旁分泌的形式導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)一步擴(kuò)大。HMGB1作為一種重要的“晚期”炎性細(xì)胞因子不僅能促使TNF-α、IL-1等表達(dá)，還能

3、激活ERK激酶、P38MAP K激酶、JNK激酶并促使核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB發(fā)生核移位。這些研究提示，HMGB1可能是致炎細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個中心環(huán)節(jié)，不僅自身分泌有級聯(lián)放大的生物學(xué)效應(yīng)，還能調(diào)節(jié)其他炎癥因子的分泌，是直接導(dǎo)致缺血再灌注損傷的“晚期”重要介質(zhì)。而尋找一種藥物抑制HMGB1，減輕炎癥反應(yīng)，成為了減輕心肌缺血再灌注損傷的重要靶點(diǎn)。
　　 甘草甜素(Glcyrrhizin，GL)是一種提取甘草根部的活性組分，具有抗炎

4、癥、免疫調(diào)節(jié)作用、抗過敏等作用。大量的文獻(xiàn)證實(shí)甘草甜素可以通過抑制炎癥反應(yīng)，減輕腦、脊髓、腸道、肝臟等器官的缺血再灌注損傷，而其在心肌缺血再灌注損傷中是否同樣具有保護(hù)作用，目前國內(nèi)外均尚未見研究，這也是本研究的主要出發(fā)點(diǎn)之一。
　　 總上所述，我們設(shè)計了甘草甜素干預(yù)心肌缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)其是否具有心肌保護(hù)作用，以及與HMGB1的關(guān)系，進(jìn)一步闡述甘草甜素在缺血再灌注損傷中的保護(hù)機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　

5、 1.建立大鼠心肌缺血再灌注模型。
　　 2.觀察實(shí)驗(yàn)各組缺血再灌注大鼠血流動力學(xué)情況變化。
　　 3.觀察實(shí)驗(yàn)各組缺血再灌注大鼠心肌缺血壞死情況及其病理改變。
　　 4.觀察實(shí)驗(yàn)各組炎癥因子的表達(dá)以及HMGB1的表達(dá)情況。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 實(shí)驗(yàn)大鼠分為:假手術(shù)(Sham)組:共10只，術(shù)前7天，每天大鼠尾靜脈注射生理鹽水1ml，模型建立時只穿線，不結(jié)扎;缺血再灌注組(NS):術(shù)前7天，每

6、天大鼠尾靜脈注射生理鹽水1ml。結(jié)扎冠狀血流30分鐘，放松結(jié)扎線后再灌注1小時，造成I/R損傷模型;甘草甜素干預(yù)(GL)組:術(shù)前7天，每天大鼠尾靜脈注射甘草甜素預(yù)處理(10 mg/kg)，甘草甜素+重組HMGB1組(GL+rHMGB1):術(shù)前7天，每天大鼠尾靜脈注射甘草甜素預(yù)處理(10 mg/kg)。結(jié)扎冠脈血流30分鐘后大鼠尾靜脈立即給予重組HMGB1（100μg/鼠）。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)扎冠狀血流30分鐘，放松結(jié)扎線后再灌注1小

7、時，造成心肌缺血再灌注損傷模型，進(jìn)行有關(guān)指標(biāo)的檢測。檢測各組造模后從0分鐘到24小時血清HMGB1水平，炎性細(xì)胞因子水平以及血流動力學(xué)指標(biāo)，并檢測其相關(guān)梗死面積及病理變化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1:實(shí)驗(yàn)各組之間血流動力學(xué)指標(biāo):心率、平均動脈壓、收縮壓乘積等無明顯差異(P＞0.05)。
　　 2:NS組心肌梗死面積最大(P＜0.05)，GL可以減少心肌梗死面積(P＜0.05)，GL+rHMGB1組心肌梗死面積較

8、GL組明顯(P＜0.05)，但仍低于NS組(P＜0.05);而且各組之間心肌缺血面積無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 3:Sham組大鼠心肌纖維完整，細(xì)胞核、細(xì)胞漿完整;NS組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞有破裂及溶解現(xiàn)象，可見壞死細(xì)胞，炎細(xì)胞浸潤。GL組心肌細(xì)胞部分間質(zhì)有水腫，少量炎細(xì)胞浸潤， GL+HMGB1組心肌細(xì)胞排列紊亂，染色不均，可見細(xì)胞水腫，點(diǎn)狀壞死，較NS組減少(P＜0.05)。
　　 4:NS組心肌肌鈣蛋白，LDH

9、，AST等水平最高(P＜0.05)，GL組較NS組下降(P＜0.05)，GL+rHMGB1組心肌梗死面積較GL組增加(P＜0.05)，但仍低于NS組(P＜0.05);
　　 5:NS組HMGB1水平和炎性細(xì)胞因子TNF-α，IL-6水平最高(P＜0.05)，GL-組血清HMGB1水平和炎性細(xì)胞因子TNF-α，IL-6等水平顯著降低(P＜0.05)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論及意義:
　　 1: HMGB1可以增加心肌缺血再

10、灌注損傷中炎性細(xì)胞因子TNF-α，IL-6等表達(dá)，增加心肌梗死面積。
　　 2:GL可能通過抑制心肌缺血再灌注后HMGB1的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，減少心肌缺血再灌注損傷。
　　 第二部分:甘草甜素對大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究
　　 背景: 甘草甜素是一種提取甘草根部的活性組分，具有抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)作用、抗過敏等作用。國外學(xué)者已有報告其對缺血再灌注誘導(dǎo)損傷實(shí)驗(yàn)動物器官如脊椎，肝臟和大腦等有保護(hù)作用，

11、同時在我們前面的課題中已證實(shí)甘草甜素在心肌缺血再灌注損傷中同樣具有保護(hù)作用。但甘草甜素干預(yù)對缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的影響尚未有報道，這是本課題的出發(fā)點(diǎn)之一。
　　 近年來人們對凋亡在心肌缺血再灌注損傷中的認(rèn)識逐漸加深，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡，心肌缺血再灌注損傷時心肌凋亡是其中重要機(jī)制之一，減少心肌細(xì)胞凋亡，可以明顯改善心功能。Bax和Bcl-2基因是調(diào)控凋亡的主要基因，其蛋白水平高低與凋亡調(diào)控直接相關(guān):Bax增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡

12、，Bcl-2增加，抑制細(xì)胞凋亡。細(xì)胞色素C(Cyt C)從線粒體釋放后可以誘導(dǎo)Bax基因從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，引起細(xì)胞凋亡，而Bcl-2可以阻止細(xì)胞色素C的釋放，抑制細(xì)胞凋亡。Caspases酶是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，其中Caspases-3是Caspases級聯(lián)瀑布下游最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶，Bax蛋白可以使細(xì)胞色素C通過線粒體膜，激活Caspases-9，進(jìn)一步激活Caspases-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。由上可見Bax、Cyt C以及Caspa

13、se-3等蛋白在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要的作用，所以在我們的課題中，對甘草甜素干預(yù)對Bax、Cyt C等的影響也進(jìn)行了相關(guān)的研究。
　　 最近絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑在心肌細(xì)胞凋亡中的作用日益受到關(guān)注。MAPK有4個主要的亞家族:細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)，c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)。本課題的出發(fā)點(diǎn)在于證實(shí)甘草甜素對缺血再灌注心肌細(xì)

14、胞凋亡的影響，其分子機(jī)制是否與蛋白激酶(MAPK)途徑，特別是JNK通路有關(guān)。針對這一問題進(jìn)行了本研究，進(jìn)一步探討其保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　 1.明確甘草甜素干預(yù)后各組心肌細(xì)胞凋亡的情況。
　　 2.明確甘草甜素干預(yù)對心肌Bax、Cyt C表達(dá)以及Caspase3活性等的影響。
　　 3.研究甘草甜素對磷酸激酶相關(guān)信號通路的影響，特別是JNK通路的關(guān)系，進(jìn)一步闡述其對缺血再灌

15、注心肌凋亡的影響，及其心肌保護(hù)作用的機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 實(shí)驗(yàn)大鼠分為:假手術(shù)(Sham)組:共10只，術(shù)前7天，每天大鼠尾靜脈注射生理鹽水1ml，模型建立時只穿線，不結(jié)扎;缺血再灌注組(NS):術(shù)前7天，每天大鼠尾靜脈注射生理鹽水1ml。結(jié)扎冠狀血流30分鐘，放松結(jié)扎線后再灌注1小時，造成I/R損傷模型;甘草甜素干預(yù)(GL)組:術(shù)前7天，每天大鼠尾靜脈注射甘草甜素預(yù)處理(10 mg/kg)，甘草甜素+重組HM

16、GB1組(GL+rHMGB1)組:術(shù)前7天，每天大鼠尾靜脈注射甘草甜素預(yù)處理(10 mg/kg)。結(jié)扎冠脈血流30分鐘后大鼠尾靜脈立即給予重組HMGB1(∈)100μg/鼠）。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)扎冠狀血流30分鐘，放松結(jié)扎線后再灌注1小時，造成心肌缺血再灌注損傷模型，進(jìn)行有關(guān)指標(biāo)的檢測。Tunnel染色檢測心肌細(xì)胞凋亡情況，免疫印跡法檢測心肌凋亡Bax、Cyt C基因，心肌細(xì)胞caspase-3活性。此外，還對缺血再灌注誘導(dǎo)的蛋白激

17、酶家族包括ERK1/2、JNK以及p38磷酸化進(jìn)行了分析。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.Tunnel染色結(jié)果提示NS組心肌細(xì)胞凋亡最明顯(P＜0.05)，GL組心肌細(xì)胞凋亡程度較之下降(P＜0.05)，GL+rHMGB1組心肌凋亡較GL組較明顯，但仍低于NS組(P＜0.05);
　　 2:免疫印跡法顯示GL可以改變Bax基因和Cyt C的細(xì)胞內(nèi)分布，抑制凋亡過程中Bax基因從細(xì)胞質(zhì)向線粒體轉(zhuǎn)移，并使細(xì)胞色素C從線

18、粒體到細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移減少，而甘草甜素+重組HMGB1組的抑制作用減弱(P＜0.05);總體細(xì)胞水平未見Bax及細(xì)胞色素C的變化(P＞0.05)。
　　 3:GL可以抑制JNK細(xì)胞通路磷酸化(P＜0.05)，而對ERK1/2或P38磷酸化無影響(P＞0.05)，而GL+rHMGB1組的抑制作用減弱，但JNK磷酸化水平仍低于NS組(P＜0.05)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論及意義:
　　 1:甘草甜素可以改變Bax基因和Cyt C

19、的分布，減輕再灌注后心肌凋亡，對心肌有保護(hù)作用。
　　 2:甘草甜素減輕心肌細(xì)胞凋亡，對缺血再灌注大鼠的心肌保護(hù)機(jī)制可能與抑制JNK磷酸化有關(guān)
　　 第三部分:JNK/Bax細(xì)胞通路在大鼠心肌缺血再灌注中的意義
　　 背景:
　　 缺血再灌注損傷是指組織器官如心、腦、腎等在一定時間的缺血后，在重新恢復(fù)血供后，不僅不能恢復(fù)改善組織器官的功能，反而起到加重功能代謝障礙以及組織損害，其中實(shí)驗(yàn)表明絲裂原活化蛋白激

20、酶(MAPK)途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與了缺血再灌注的發(fā)生。其中JNK細(xì)胞通路在心肌缺血后細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要作用，其作為細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)的重要途徑，廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)、炎癥、腫瘤等多種生理、病理生理過程，在缺血再灌注、心臟驟停、炎癥反應(yīng)等中起到了重要作用。
　　 細(xì)胞凋亡是一種主動地、程序性和生理性的細(xì)胞死亡，指在一定條件下，核細(xì)胞通過啟動內(nèi)部機(jī)制，通過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細(xì)胞自然死亡

21、過程，表現(xiàn)為一系列的細(xì)胞核變化。c-Jur氨基末端激酶(JNK)是促分裂原活化蛋白激酶家族(MAPK)成員之一，位于細(xì)胞胞質(zhì)之中，可被炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、休克創(chuàng)傷、缺血再灌注等多種因素激活，大量實(shí)驗(yàn)表明JNK細(xì)胞通路參與了細(xì)胞凋亡的病理生理過程。
　　 研究表明缺血再灌注后數(shù)分鐘就可以發(fā)現(xiàn)線粒體及細(xì)胞質(zhì)JNK被激活，可見其在心肌缺血再灌注損傷中起著重要作用;有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血區(qū)JNK活性明顯增加，采用JNK抑制劑SP6001

22、25可以阻斷Bax凋亡途徑;同樣在大鼠腦缺血再灌注模型中，采用JNK抑制劑AS601245可以明顯降低缺血再灌注引起的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，有學(xué)者在肝缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)再灌注后JNK活性明顯升高，采用JNK抑制劑可以明顯緩解肝細(xì)胞的凋亡。
　　 本課題采用了JNK抑制劑SP600125以及重組HMGB1進(jìn)行了干預(yù)，證實(shí)JNK通路以及HMGB1在缺血再灌注損傷中的作用，從而為甘草甜素通過抑制HMGB1以及抑制JNK磷酸化，對缺血再灌注

23、心肌起到保護(hù)作用的機(jī)制提供一定的論據(jù)。針對這些問題，我們設(shè)計了本實(shí)驗(yàn)，明確JNK通路及HMGB1在心肌缺血再灌注中細(xì)胞凋亡的意義，進(jìn)一步闡述心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　 1.建立大鼠心肌缺血再灌注模型，觀察實(shí)驗(yàn)各組缺血再灌注大鼠心肌凋亡情況，觀察心肌Bax，CytochromeC，Caspase3的表達(dá)情況。
　　 2.并用JNK抑制劑SP600125以及重組HMGB1進(jìn)行干預(yù)，明確JNK通

24、路以及HMGB1在心肌缺血再灌注中細(xì)胞凋亡的意義，進(jìn)一步證實(shí)甘草甜素的心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 實(shí)驗(yàn)大鼠分為:缺血再灌注組(NS組):共10只，冠脈結(jié)扎前30分鐘大鼠尾靜脈注射生理鹽水1ml，結(jié)扎冠狀血流30分鐘，放松結(jié)扎線后再灌注1小時，造成I/R損傷模型;SP600125干預(yù)組(NS+SP600125組):冠脈結(jié)扎前30分鐘，大鼠尾靜脈注射SP600125溶液1ml(0.5 mg/kg)，結(jié)

25、扎冠狀血流30分鐘，放松結(jié)扎線后再灌注1小時，造成I/R損傷模型，24小時后進(jìn)行有關(guān)指標(biāo)的檢測。SP600125+重組HMGB1干預(yù)組(SP600125+rHMGB1組):冠脈結(jié)扎前30分鐘，經(jīng)大鼠尾靜脈注射SP600125溶液1ml預(yù)處理(0.5 mg/kg)，結(jié)扎前大鼠尾靜脈立即給予重組HMGB1（100μg/鼠），結(jié)扎冠狀血流30分鐘，放松結(jié)扎線后再灌注1小時，造成I/R損傷模型，24小時后進(jìn)行有關(guān)指標(biāo)的檢測，Tunnel染色檢測

26、心肌細(xì)胞凋亡情況，免疫印跡法檢測心肌凋亡Bax、Cyt C蛋白，心肌細(xì)胞caspase-3以及JNK活性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1:免疫印跡法顯示NS組JNK活性最強(qiáng)(P＜0.05)，NS+SP600125組JNK活性最弱(P＜0.05)。
　　 2:Tunnel染色結(jié)果提示NS組心肌細(xì)胞凋亡最明顯(P＜0.05)，NS+SP600125組心肌細(xì)胞凋亡程度較之下降(P＜0.05)，SP600125+rHMGB1

27、組心肌凋亡較NS+ SP600125組較明顯，但仍低于NS組(P＜0.05);
　　 3:免疫印跡法顯示SP600125可以改變Bax基因和Cyt C的細(xì)胞內(nèi)分布，抑制凋亡過程中Bax基因從細(xì)胞質(zhì)向線粒體轉(zhuǎn)移，并使細(xì)胞色素C從線粒體到細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移減少，而SP600125+rHMGB1組的抑制作用減弱(P＜0.05);總體細(xì)胞水平未見Bax及細(xì)胞色素C的變化(P＞0.05)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論及意義:
　　 1:HMG