廣州市A型流感病毒的遺傳進(jìn)化研究.pdf

1、研究背景和目的 流行性感冒(Influenza)簡(jiǎn)稱流感，是由人流感病毒引起的危害人類健康的常見(jiàn)急性傳染病。在每年流感的季節(jié)性流行期內(nèi)，流感病毒可以在短時(shí)間內(nèi)在全球范圍內(nèi)傳播，可造成世界上10％～20％的人口受到影響，300～500萬(wàn)嚴(yán)重病例，25～50萬(wàn)人死亡。因此對(duì)流感病毒進(jìn)行長(zhǎng)期的、全球范圍的監(jiān)測(cè)，以及對(duì)其預(yù)防控制就顯得十分必要。我國(guó)從1952開始進(jìn)行流感病毒研究，1981年加入WHO的流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)，自2000年以來(lái)，與WH

2、O合作，在全國(guó)31個(gè)省(市)和自治區(qū)開展流感監(jiān)測(cè)。廣東地區(qū)從1971年以來(lái)開展了全省流感監(jiān)測(cè)，1988年廣東地區(qū)按照WHO的規(guī)劃，建立全省流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)。廣州作為華南地區(qū)重要的城市之一，人口密集，人員流動(dòng)頻繁，與港澳及國(guó)際交往頻繁，是流感的多發(fā)地。因此對(duì)廣州流感流行的監(jiān)測(cè)，以及對(duì)流感病毒分子進(jìn)化的動(dòng)態(tài)研究是十分必要且有意義的一項(xiàng)工作。 2006年廣州市流感活動(dòng)頻繁，小規(guī)模暴發(fā)了13起H1N1亞型流感疫情，這是該亞型病毒在廣州市沉寂

3、了4年后的再次流行，在隨后的2007年又基本上銷聲匿跡，全年只分離到1株。為了解2006年廣州市流感流行的基本狀況，探究2006年和2007年廣州H1N1亞型病毒的遺傳和進(jìn)化規(guī)律，本研究挑選出45株代表株，應(yīng)用血清學(xué)、分子生物學(xué)及生物信息學(xué)的方法，鑒定了病毒的型別、擴(kuò)增和克隆了H1N1亞型流感病毒HA和NA基因，并對(duì)序列進(jìn)行了全面的分析比對(duì)。 方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，挑選了45株病毒作為代表株，并在MDCK細(xì)胞中進(jìn)行分離

4、培養(yǎng)；通過(guò)血凝和血凝抑制試驗(yàn)、RT-PCR．法對(duì)病毒進(jìn)行鑒定分型；運(yùn)用RT-PCR的方法擴(kuò)增全部毒株的全長(zhǎng)HA基因，和7株病毒(包括暴發(fā)期的5株和散發(fā)期的2株)的全長(zhǎng)NA基因，建立了T-A克隆并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用DNAStar軟件包中EditSeq進(jìn)行編輯和拼接，并推導(dǎo)出氨基酸序列。 從NCBI流感病毒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)下載2005年～2008年亞洲地區(qū)各宿主中分離的H1N1亞型流感病毒的HA和NA基因ORF序列和氨基酸序列。用Clu

5、stal X軟件對(duì)HA和NA基因ORF序列進(jìn)行比對(duì)，MEGA3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。用DNAStar軟件包中的MegAlign程序?qū)Π被嵝蛄羞M(jìn)行比對(duì)，計(jì)算各毒株與疫苗株的同源性，并在3D-JIGSAW蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)兩株病毒的HA蛋白空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，分析其氨基酸的改變對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的可能影響。 結(jié)果 1、在MDCK細(xì)胞中成功培養(yǎng)出45株病毒，經(jīng)鑒定分型，其中21株為B型，24株為H1N1亞型，無(wú)H3N2亞型

6、。發(fā)病人群集中在中、小學(xué)校，特別是小學(xué)校，H1N1亞型主要發(fā)生在大學(xué)里。2006年流感流行季節(jié)內(nèi)出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)流行株的交替，3月和4月以B型為主，5月份病例數(shù)較前兩個(gè)月明顯減少，到了6月，H1N1亞型病毒在大學(xué)城出現(xiàn)小規(guī)模暴發(fā)，6月下旬病例數(shù)到達(dá)頂峰，7月份疫情得到控制，病例數(shù)明顯下降。 2、H1N1亞型病毒的血凝抑制效價(jià)與用標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗體作的血凝抑制效價(jià)(1：320)相仿，均未低于4倍效價(jià)，說(shuō)明抗原變異幅度不大。 3、2

7、4個(gè)H1N1亞型毒株的HA基因全長(zhǎng)，除毒株44在1759位插入一個(gè)堿基A為1776bp，余均為1775bp，ORF序列長(zhǎng)度均為1698bp，均由566個(gè)aa組成。NA基因全長(zhǎng)，除506在14位缺失一個(gè)堿基為1461bp，其它6株均為1462bp，ORF序列長(zhǎng)為1413bp，氨基酸序列長(zhǎng)度為471aa。 4、從HA-ORF和NA-ORF的遺傳和進(jìn)化分析中可以看出，大部分毒株有明顯的時(shí)間分化特點(diǎn)，即同一年分離到的毒株同源性相對(duì)較高，

8、如果是同一年同一國(guó)家的病毒株則同源性最高。24個(gè)分離株中有23株的HA基因和7個(gè)分離株的NA基因同源性較高，只有44號(hào)分離株的HA基因與其它HA基因的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，與2005年從其它國(guó)家分離的毒株關(guān)系較近。44號(hào)分離株與2006～2007年疫苗株New Caledonia／20／1999株進(jìn)化關(guān)系較近，而其它分離株都與2007～2008年疫苗株Solomon Islands／3／2006株進(jìn)化關(guān)系較近。 5、24株分離株中有20

9、株在HA蛋白Sb抗原區(qū)205位和206位同時(shí)發(fā)生了變異，206位均是A-T變異，205位有15株是R-M變異、2株是R-N變異、3株是R-S變異。在205位發(fā)生R-S變異的3株在Ca1抗原區(qū)的183位和187位，還分別發(fā)生了A-E和E-K的變異。在暴發(fā)期分離的506株，除了在205位和206位分別發(fā)生R-M和A-T的變異外，還在Sb抗原區(qū)170位還發(fā)生了G-R變異。計(jì)算與兩個(gè)疫苗株HA蛋白氨基酸序列的同源性發(fā)現(xiàn)，與Solomon Isl

10、ands／3／2006株的同源性略高于與New Caledonia／20／1999株的同源性。對(duì)HA蛋白3-D空間結(jié)構(gòu)分析還發(fā)現(xiàn)205位和206位的改變引起受體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的微小變化。有22個(gè)分離株的HA蛋白有10個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，1561株有9個(gè)和657株11個(gè)。HAO分割位點(diǎn)無(wú)變異。 6、7個(gè)分離株中的5個(gè)毒株的NA蛋白在344位(抗原區(qū)4)和367位(抗原區(qū)5)分別發(fā)生D-N和L-I的變異，506號(hào)分離株同時(shí)還在398位(

11、抗原區(qū)6)發(fā)生了D-N的變異。所有的唾液酸結(jié)合位點(diǎn)都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)變異。其中5個(gè)毒株有7個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，506號(hào)分離株有8個(gè)。 結(jié)論 1、2006年廣州市流感流行高峰在3～6月份，H1N1亞型、B型交替成為優(yōu)勢(shì)流行株，未分離到H3N2亞型。 2、2006～2007年H1N1亞型流感病毒在HA蛋白的抗原區(qū)、受體結(jié)合位點(diǎn)、潛在糖基化位點(diǎn)和NA蛋白的抗原區(qū)發(fā)生了點(diǎn)突變，這很有可能是引起該亞型流感病毒再次暴發(fā)的原因之一。