抗鴨瘟病毒活性物質(zhì)的篩選及白藜蘆醇抗鴨瘟病毒活性與作用機(jī)制研究.pdf

1、皰疹病毒臨床治療藥物以核苷酸類似物為主。該類藥物作用靶點類似，容易導(dǎo)致交叉耐藥性，目前臨床已有耐藥毒株出現(xiàn)。因此，發(fā)現(xiàn)新的靶點藥物是未來研究皰疹病毒藥物的重點。鴨瘟病毒(Duck Plague Virus，DPV)是一種急性傳染性病毒，該病毒屬皰疹病毒科。目前，沒有針對DPV的治療藥物出現(xiàn)，生產(chǎn)上以注射疫苗預(yù)防為主。本研究擬從天然藥用產(chǎn)物中篩選出具有抗DPV活性的物質(zhì)，并對該物質(zhì)抗病毒機(jī)制進(jìn)行研究，希望能找到新的作用靶點，為鴨瘟的治療提

2、供新的方法，也為抗皰疹類病毒藥物的開發(fā)提供新的靶點和思路。本研究分為以下幾個部分:
　　1、體外抗DPV活性物質(zhì)篩選選取多種天然藥用產(chǎn)物，運(yùn)用細(xì)胞病變法和噻唑藍(lán)比色法相結(jié)合的方法，進(jìn)行體外抗DPV研究。結(jié)果如下:①傳統(tǒng)中藥粗提物中，虎杖和茜草的醇提物具有一定的抗DPV活性:虎杖醇提物對DPV最高抑制率為76.5％;茜草醇提物對DPV最高抑制率為48.91％。②印楝種仁醇提物石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和水層分對DPV的最高抑制率分

3、別為13.23％、29.24％和11.72％。③油樟揮發(fā)油及其主要活性成分中，松油烯-4-醇、α-松油烯、γ-松油烯和1，8-桉葉素對DPV抑制率分別為4.42％、14.27％、25.33％和21.02％。由以上結(jié)果可知，所檢測的多種天然藥用產(chǎn)物中，虎杖醇提物抗DPV效果最好。
　　2、白藜蘆醇體外抗DPV活性研究以虎杖中主要藥用成分白藜蘆醇作為研究對象，通過CPE、MTT法和滴度法檢測了白藜蘆醇體外抗DPV活性。結(jié)果如下:①利用

4、CPE法觀察白藜蘆醇對DPV引起的鴨胚成纖維細(xì)胞（Duck embryo fibroblasts，DEFs）病變的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)白藜蘆醇濃度為31.25μg/mL，能夠完全抑制細(xì)胞病變。②利用MTT法檢測白藜蘆醇對DPV的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇體外抗DPV的半數(shù)抑制濃度為3.85±0.08μg/mL，半數(shù)有毒濃度為61.07±0.24μg/mL，治療指數(shù)為15.86。③通過滴度法檢測白藜蘆醇作用后DEFs中繁殖的DPV的滴

5、度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇能夠顯著降低病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖后的滴度。由以上結(jié)果可知，白藜蘆醇具有良好的體外抗DPV活性。
　　3、TaqMan絕對熒光定量PCR方法的建立和白藜蘆醇對DPV體外復(fù)制的影響以DPVUL30基因為目標(biāo)片段，設(shè)計引物和TaqMan探針，建立熒光定量PCR方法，結(jié)果表明，該方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好(R2=0.997)，擴(kuò)增效率(E)為99.7％，且具有良好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。利用該方法檢測白藜蘆醇對DP

6、V在DEFs中的生長影響，結(jié)果如下:①病毒感染組:病毒粒子在感染DEFs8h時開始逐漸增多，到48h達(dá)到最高點。②白藜蘆醇作用組:病毒粒子拷貝數(shù)24h內(nèi)無明顯增多，24h后病毒粒子拷貝數(shù)開始增長，增長速度顯著低于病毒感染組(p＜0.05)。以上結(jié)果表明，白藜蘆醇能夠延長DPV在DEFs中的潛伏期，對該病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制有明顯的抑制作用。
　　4、白藜蘆醇體外抗DPV作用特征的研究通過不同方式用藥、不同時間加藥以及透射電鏡等方法

7、研究白藜蘆醇體外抗DPV作用特征。結(jié)果如下:①以胞外直接殺滅、藥物對細(xì)胞的保護(hù)、病毒穿入和病毒胞內(nèi)繁殖四種方式，考察白藜蘆醇體外抗DPV活性。利用已建立的TaqMan熒光定量PCR方法檢測各方式下病毒繁殖后的拷貝數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):白藜蘆醇通過影響病毒在胞內(nèi)的繁殖發(fā)揮作用。②利用滴度法檢測在病毒進(jìn)入細(xì)胞后第0h，2h，4h，6h，8h加入白藜蘆醇情況下病毒滴度變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各時間點加藥組病毒滴度均低于病毒感染組;各用藥組中，第0-6h加

8、藥組病毒滴度顯著低于第8h加藥組(p＜0.01)。結(jié)果表明，白藜蘆醇主要是在病毒進(jìn)入細(xì)胞后的前8h發(fā)揮抗病毒作用的。③通過透射電鏡揭示病毒進(jìn)入細(xì)胞后在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程，并對白藜蘆醇作用下的染毒細(xì)胞進(jìn)行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇作用下的DPV在DEFs細(xì)胞核內(nèi)的病毒核酸復(fù)制和核衣殼的形成受到阻礙。由以上結(jié)果可知，白藜蘆醇主要是在作用于DPV感染宿主細(xì)胞后的前8h內(nèi)發(fā)揮抗病毒活性，在該階段，病毒主要在宿主細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行病毒核酸的復(fù)制和相關(guān)蛋

9、白的表達(dá)。
　　5、白藜蘆醇對DPV立即早期和早期基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用研究本研究建立了SYBRGreenⅠ反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR方法，以β-actin作為內(nèi)參，研究了白藜蘆醇對UL2，UL23，UL30，UL39，UL40，IRS和TRS等立即早期和早期基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的白藜蘆醇對所檢測的基因轉(zhuǎn)錄均有明顯的抑制效果，白藜蘆醇濃度越高，基因的轉(zhuǎn)錄水平越低。當(dāng)白藜蘆醇濃度為31.25μg/mL時，被檢測的所有基因24

10、h內(nèi)無明顯轉(zhuǎn)錄發(fā)生。結(jié)果表明，高濃度白藜蘆醇能夠明顯抑制上述基因的轉(zhuǎn)錄水平。由于上述基因?qū)儆诓《綝NA復(fù)制必需基因，它們的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接參與病毒核酸的復(fù)制過程，其中IRS、TRS和UL23作為病毒立即早期藎因，在早期基因的轉(zhuǎn)錄中也發(fā)揮重要的作用。因此，白藜蘆醇對立即早期基因的抑制作用可能是導(dǎo)致DPV核酸復(fù)制受阻的關(guān)鍵原因。
　　6、白藜蘆醇體內(nèi)抗DPV活性及對相關(guān)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)作用研究通過皮下注射接毒的方法建立DPV-CHv強(qiáng)毒株櫻桃

11、谷鴨雛鴨DPV模型。接毒后第1～7d分別用不同劑量的白藜蘆醇口服灌喂給藥，停藥后觀察7d，結(jié)果如下:①各劑量組白藜蘆醇均能明顯延遲染毒鴨的發(fā)病時間和死亡時間:病毒感染組第4d開始發(fā)病，第5d開始出現(xiàn)死亡，第8d死亡率為100％;白藜蘆醇治療組第5d開始發(fā)病，第6d開始出現(xiàn)零星死亡，第8d各組死亡率均為20％。停藥一周后，高、中、低三個治療組死亡率分別為80％，60％與50％。②白藜蘆醇能夠明顯改善染毒鴨各臟器組織病變情況:病毒感染組鴨全

12、身各臟器有明顯出血充血現(xiàn)象，肝臟出現(xiàn)肉眼可見的壞死灶，治療組無明顯肉眼可見的病理變化。HE染色檢測，病毒感染組肝脾和法氏囊均出現(xiàn)多個壞死灶，白藜蘆醇治療組肝脾和法氏囊無壞死灶。透射電鏡下，病毒感染組肝脾細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，細(xì)胞胞核和胞質(zhì)內(nèi)充滿各生長階段的DPV病毒顆粒。白藜蘆醇治療組肝脾細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞內(nèi)無明顯可見的DPV病毒顆粒。③白藜蘆醇顯著抑制病毒在染毒鴨體內(nèi)的復(fù)制:治療組鴨外周血的DPV病毒拷貝數(shù)增長時間比病毒感染組晚2～3d;增

13、長幅度明顯低于病毒感染組。④在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子方面，不同劑量的白藜蘆醇對不同的細(xì)胞因子影響不同:與病毒感染組和正常組相比，對INF-α和INF-γ具有促進(jìn)作用，對IL-2和IL-12具有抑制作用，對IL-4影響不明顯;不同劑量之間比較，對INF-α、IL-2和IL-12的影響與濃度呈負(fù)相關(guān)性，濃度越高，各細(xì)胞因子的含量越低，不同劑量組的INF-γ和IL-4差異不明顯。劑量越高導(dǎo)致的細(xì)胞因子含量越低可能是高劑量組死亡率高于低劑量組的主要原因。

14、
　　由以上結(jié)果可知，白藜蘆醇具有良好的抗DPV活性，作用機(jī)制主要體現(xiàn)在兩個方面:一是針對病毒本身，白藜蘆醇能夠有效抑制DPV立即早期基因及早期基因的轉(zhuǎn)錄，阻礙病毒在宿主細(xì)胞核內(nèi)的病毒核酸復(fù)制，從而阻斷病毒繁殖過程達(dá)到抑制病毒的效果，這種抑制效果與白藜蘆醇的濃度呈正相關(guān)性;二是通過作用于動物機(jī)體免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)病毒感染相關(guān)的細(xì)胞因子來達(dá)到影響病毒對機(jī)體損傷的效果。這種效果與白藜蘆醇的劑量之間關(guān)系復(fù)雜，相同的劑量對不同的細(xì)胞因子影響不