EGCG對大鼠放射性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、放射性肺損傷(radioactive lung injury)是胸部腫瘤放療、骨髓移植輻射預(yù)處理及核泄露事故常見的并發(fā)癥。隨著腫瘤發(fā)病率的逐年增加,接受放射治療的患者也大幅增加,盡管近年來放射治療技術(shù)水平和設(shè)備的大幅進(jìn)步,減輕了腫瘤周圍正常組織的損傷,但放射性肺損傷的發(fā)生率仍然居高不下。目前臨床上缺乏有效的防治放射性肺損傷措施,使其成為影響腫瘤患者放療的主要?jiǎng)┝肯拗菩砸蛩?因此,放射性肺損傷的防治是放射醫(yī)學(xué)和臨床腫瘤學(xué)急待解決的問題。<

2、br>　　近年來大量研究表明,氧化應(yīng)激在放射性肺損傷及纖維化形成中發(fā)揮著重要作用。國內(nèi)外多家科研機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)長時(shí)間的氧化應(yīng)激和正常組織的持續(xù)性缺氧與放射性肺損傷的發(fā)展密切相關(guān),可能是導(dǎo)致肺持續(xù)性損傷的原因。當(dāng)射線作用于肺組織時(shí),由于其對水分子和靶分子的離子化作用,可導(dǎo)致活性氧類物質(zhì)迅速爆發(fā)性生成。瞬間大量生成的ROS一方面直接造成肺組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損傷,另一方面激活炎癥細(xì)胞間接加重組織損傷。照射引起的氧自由基生成增加可引起應(yīng)激敏感的激酶和轉(zhuǎn)錄

3、因子的迅速激活,炎癥性細(xì)胞因子生成增加。照射引起肺損傷后,肺泡巨噬細(xì)胞被激活,在發(fā)揮清除壞死組織作用過程中可產(chǎn)生大量的ROS,此外它還通過趨化作用導(dǎo)致更多的免疫效應(yīng)細(xì)胞(淋巴細(xì)胞,中性粒細(xì)胞等)浸潤受損的肺組織,而這些細(xì)胞在發(fā)揮生物效應(yīng)的同時(shí)也會產(chǎn)生大量ROS。機(jī)體的內(nèi)源性ROS主要在細(xì)胞線粒體中生成,在線粒體的電子傳遞鏈中存在電子滲漏,其部分還原O2而產(chǎn)生,此外部分ROS還來自于細(xì)胞內(nèi)生性的黃素酶(如:黃嘌呤氧化酶),脂肪氧化酶,環(huán)氧

4、合酶以及漿膜相關(guān)的氧化酶(如:吞噬細(xì)胞NAPDH氧化酶)等催化產(chǎn)物。這些大量生成的ROS能很快將機(jī)體的抗氧化能力消耗殆盡,加重肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷,導(dǎo)致肺部炎癥持續(xù)存在。
　　NrF2-ARE信號通路是迄今發(fā)現(xiàn)的最重要的抗氧化應(yīng)激相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路。NrF2-ARE信號通路在抗腫瘤、抗炎、抗凋亡等可發(fā)揮重要的細(xì)胞保護(hù)作用,逐漸引起人們的重視。
　　當(dāng)細(xì)胞遭到ROS或親電子物質(zhì)攻擊時(shí),一方面對Keap1分子的半胱氨酸殘基進(jìn)行化學(xué)修飾

5、,引起Keap1構(gòu)象改變,導(dǎo)致NrF2-Keap1復(fù)合體解離,NrF2入核,另一方面通過激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和蛋白激酶C(PKC)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)使NrF2分子磷酸化而激活?；罨腘rF2分子與Maf蛋白結(jié)合成異二聚體后識別ARE元件啟動Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄,提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力。受NrF2-ARE信號通路調(diào)控的抗氧化酶主要有血紅素加氧酶(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS

6、)、NAD(P)H:醌氧化還原酶-1(NQO-1)、超氧化物歧化酶等。NrF2在肺組織細(xì)胞內(nèi)呈高表達(dá)可能與其暴露于外環(huán)境容易接觸活性氧及毒素有關(guān)。放射線作用于肺組織時(shí),有大量ROS生成,上調(diào)NrF2水平對調(diào)控肺內(nèi)氧化/抗氧化平衡起重要作用。
　　大量研究表明,表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)具有抗氧化、抗脂質(zhì)過氧化、清除自由基、抗突變和抗腫瘤形成等生物學(xué)活性和藥理效應(yīng)。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基,

7、可作為供氫體而提供H+,許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)EGCG是強(qiáng)供氫體抗氧化劑和自由基清除劑。EGCG尚可通過與金屬螯合以減少離子對氧化反應(yīng)的催化以及增強(qiáng)抗氧化物酶活性而發(fā)揮抗氧化作用。EGCG可通過介導(dǎo)STAT信號通路,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子T-bet和維生素A相關(guān)孤兒受體γ/α(RORγ/α)選擇性抑制CD4+T細(xì)胞生成IFN-γ和IL-17,直接抑制Th1和Th17細(xì)胞分化,還可通過改變CD80和CD86表達(dá)而抑制抗原提呈細(xì)胞(APC)的協(xié)同刺激功能

8、,證實(shí)了EGCG可通過抑制免疫細(xì)胞合成釋放炎癥因子和調(diào)節(jié)免疫功能發(fā)揮抗炎作用。EGCG可通過誘導(dǎo)激活Nrf2-Keap1信號途徑提高內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激能力。共聚焦顯微鏡,免疫印跡及RT-PCR研究證實(shí),EGCG可明顯誘導(dǎo)NrF2表達(dá)增加并促進(jìn)NrF2-Kaep1復(fù)合體解離,促進(jìn)NrF2分子入核上調(diào)抗氧化酶和解毒酶表達(dá)。此外,EGCG尚能通過抑制NF-κB表達(dá)而發(fā)揮抗炎活性。
　　EGCG的抗氧化應(yīng)激作用可能對放射性肺損傷有治療或控制

9、肺纖維化發(fā)展的作用,目前此方面研究匱乏,因此,我們利用Co60源建立大鼠放射性肺損傷模型,以EGCG進(jìn)行干預(yù),探討其對放射性肺損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制,以期為放射性肺損傷防治提供新的途徑和參考。
　　第一部分大鼠放射性肺損傷模型的建立與鑒定
　　目的:采用Co60γ射線照射大鼠全肺建立大鼠放射性肺損傷模型,進(jìn)行持續(xù)病理學(xué)觀察,考察氧化應(yīng)激在此中的作用,為下一步防治放射性肺損傷研究提供大鼠模型和理論依據(jù)。
　　方法:采用

10、Co60源22Gy單次照射SD大鼠全肺。分別于照射前、照后1天,7天,15天,21天,30天,60天,120天活殺大鼠,計(jì)算肺系數(shù),右肺行HE染色、Masson染色及天狼猩紅染色,觀察肺組織病理變化并對大鼠肺泡炎及纖維化程度進(jìn)行評分,免疫組化法檢測肺組織α-SMA、SPB表達(dá)情況;左肺進(jìn)行羥脯氨酸含量測定;血清測定MDA含量、總SOD活力和TGF-β1含量。
　　結(jié)果:
　　(1)大鼠肺臟于照后15天開始出現(xiàn)明顯大體改變,受

11、照部位出現(xiàn)脫毛和皮膚潰瘍,肺臟腫脹,表面可見出血點(diǎn),并隨時(shí)間延長逐漸加重,至照后30天最為嚴(yán)重。照后60天至120天,肺臟塌陷,表面可見結(jié)節(jié)狀及條索狀灰白色纖維化病灶。肺系數(shù)自照后15天(5.864±0.148)起顯著增加,與正常對照組(5.098±0.445)比較,P<0.05,隨時(shí)間延長肺系數(shù)逐漸增加,照后60天至120天略有降低但仍明顯高于正常對照組(P<0.05)。
　　(2)照后7天至30天肺組織以間質(zhì)性滲出性炎癥為主要

12、病變,并隨時(shí)間延長逐漸加重,肺泡炎評分在照后7天(8.833±1.329)開始明顯增加(與正常對照組比較,P<0.001),至照后30天肺泡炎評分(22.333±2.066)達(dá)最高,照后60天(21.167±2.317)和120天(21.333±3.266)肺泡炎評分略有降低,但與照后30天比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　(3)照后60天至120天以肺組織細(xì)胞增生性炎癥和纖維化病灶形成為主要病變,肺纖維化評分在照后15

13、天(8.833±2.137)開始明顯增加(與正常對照組比較,P=0.001),照后21天與15天無明顯差異(P>0.05),照后30天至120天肺纖維化評分進(jìn)行性增加(組間比較,P<0.05)。
　　(4)肺組織HYP含量自照后15天(0.442±0.056)起明顯增高,與正常對照組(0.168±0.021)比較,P<0.05,且其含量隨時(shí)間延長逐漸增加。
　　(5)血清T-SOD活力照后1天(104.168±8.975)至

14、7天(109.075±12.719)短暫增加,與正常對照組(79.613±10.210)比較,照后1天P=0.003,照后7天P<0.001,照后15天T-SOD活力又明顯降低,至照后120天T-SOD活力一直維持在較低水平,與正常對照組比較,P>0.05。
　　(6)血清MDA含量于照后1天(4.055±0.617)即出現(xiàn)明顯增高,與正常對照組(2.491±0.653)比較,P=0.007,其含量隨時(shí)間延長逐漸增高,與正常對照組

15、比較,P<0.001。
　　(7)大鼠血清TGF-β1含量自照后15天(2816.52±191.142)開始明顯增加,與正常對照組(2150.31±127.768)比較,P<0.001,且隨時(shí)間延長其含量逐漸增高。
　　(8)肺組織α-SMA表達(dá)自照后15天(0.085±0.014)開始增加,但較正常對照組(0.048±0.013)比較,P>0.05,照后60天至照后120天其表達(dá)顯著,與正常對照組比較,P<0.05。

16、>　　(9)肺組織SPB表達(dá)于照后7天(0.313±0.074)明顯降低,與正常對照組(0.479±0.078)比較,P<0.05,隨時(shí)間延長其表達(dá)水平進(jìn)一步降低,照后60天至120天SPB表達(dá)略有增加,但仍顯著低于正常對照組,P<0.05。
　　結(jié)論:
　　(1)照后7天肺組織開始出現(xiàn)較明顯的炎癥改變,小血管擴(kuò)張,肺泡間隔增寬,可見炎性滲出和炎癥細(xì)胞浸潤,隨時(shí)間延長肺組織炎癥逐漸加重,至照后30天肺組織炎癥最為嚴(yán)重。

17、>　　(2)照后15天肺組織開始出現(xiàn)膠原沉積,隨時(shí)間逐漸加重,照后60天和120天肺部炎癥略減輕,出現(xiàn)以肺纖維化為主要特征的病理改變,纖維化病灶內(nèi)以Ⅰ型膠原纖維沉積為主。
　　(3)照后15天反映放射性肺損傷的血清學(xué)指標(biāo)TGF-β1水平開始明顯升高,隨時(shí)間延長升高更加明顯,提示照后大鼠的肺損傷逐漸加重。
　　(4)反映氧化應(yīng)激損傷水平的血清MDA含量自照后15天開始明顯增加,隨時(shí)間延長持續(xù)增加,與肺損傷程度相一致;血清T-S

18、OD活力僅在照后早期增加,后期活力降低明顯,甚至低于正常對照,反映出后期機(jī)體內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)的失代償,氧化應(yīng)激加重肺組織的損傷。
　　(5)肺組織α-SMA表達(dá)于照后60天至120天表達(dá)水平顯著增加,表明肌成纖維細(xì)胞在放射性肺損傷后期纖維化發(fā)生中發(fā)揮重要作用。
　　(6)照后7天肺泡Ⅱ型細(xì)胞數(shù)量顯著減少,隨時(shí)間延長進(jìn)一步減少,可能與氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷有關(guān);照后60天,尤其是120天可見增生的異常形態(tài)肺泡Ⅱ型細(xì)胞,提示

19、其可能參與了晚期放射性肺損傷的纖維化發(fā)展。
　　第二部分EGCG對大鼠放射性肺損傷防治作用及機(jī)制探索
　　目的:利用Co60源建立大鼠放射性肺損傷模型,以EGCG和地塞米松進(jìn)行干預(yù),探討EGCG對放射性肺損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:利用Co60源γ射線22Gy單次照射大鼠全肺構(gòu)建放射性肺損傷模型,照后2小時(shí)內(nèi)分別給予地塞米松注射液和EGCG干預(yù)治療。以肺系數(shù)、HE染色、Masson染色和肺組織羥脯氨酸(HYP

20、)含量觀察及評價(jià)EGCG對放射性肺炎及纖維化的改善情況;檢測大鼠血清TGF-β1含量;檢測血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力和丙二醛(MDA)含量,評價(jià)EGCG對模型大鼠氧化應(yīng)激的改善情況;免疫組化法檢測肺組織α-SMA、SPB表達(dá)情況,觀察EGCG對肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和肺泡Ⅱ型細(xì)胞的影響;利用流式微球分析技術(shù)(Cytometric bead array,CBA)檢測大鼠血清IL-6,IL-10,IFN-γ,TNF-α含量;蛋白免疫印

21、跡法(WB)檢測肺組織Nrf-2、HO-1、NQO-1表達(dá),觀察EGCG對NrF2-ARE信號通路的影響,探討EGCG的抗氧化應(yīng)激機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　(1)經(jīng)EGCG治療后,大鼠受照部位脫毛及皮膚潰瘍明顯改善,肺部充血水腫等大體改變明顯好于模型組和地塞米松組,肺系數(shù)于照后15天至60天較模型組有明顯降低(P<0.05),且照后30天至120天明顯低于地塞米松組(P<0.05)。
　　(2)EGCG組照后15天和30

22、天肺組織炎癥滲出及炎癥細(xì)胞浸潤明顯改善,肺泡炎評分與模型組比較,P<0.05;照后15天與地塞米松組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05,照后60天和120天肺部炎癥較模型組與激素組均有明顯減輕(肺泡炎評分,P<0.05)。
　　(3)EGCG組照后30天至120天肺實(shí)質(zhì)內(nèi)膠原纖維沉積及纖維化程度明顯好于模型組和地塞米松組,肺纖維化評分比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　(4)EGCG組15天至120天肺組織HYP含量顯著

23、降低，與模型組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），照后60天和120天顯著低于地塞米松組（P＜0.05）。
　　(5)與模型組比較，EGCG組照后15天至120天血清TGF-β1含量顯著降低（P＜0.05），照后30天至120天與地塞米松組比較有顯著降低（P＜0.05）。
　　(6)與模型組比較，EGCG組照后15天至120天血清MDA含量明顯降低（P＜0.05），照后60天和120天明顯低于地塞米松組（P＜0.05）。<

24、br>　　(7)EGCG組照后15天至120天血清總SOD活力水平與正常對照組、模型組和地塞米松組比較，明顯增高（P＜0.05）。
　　(8)EGCG組照后15天血清IL-6與TNF-α水平升高不明顯，與正常對照組比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），與模型組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），IL-10和IFN-γ含量升高明顯，與正常對照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），但與模型組和地塞米松組比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0

25、.05）；照后30天至120天，大鼠血清各炎癥因子水平有所升高，但明顯低于模型組和地塞米松組（P＜0.05）。
　　(9)EGCG組照后15天和30天肺實(shí)質(zhì)內(nèi)少見α-SMA表達(dá)，OD值與正常對照組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），照后60天至120天肺組織內(nèi)可見散在α-SMA表達(dá)增加，OD值與正常對照組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），OD值與模型組比較P＜0.01，與地塞米松組比較P＜0.05。
　　(10)EGC

26、G組照后15天及30天肺組織SPB表達(dá)減少，OD值與正常對照組比較有顯著差異（P＜0.05），但較模型組和地塞米松組有明顯增加，OD值與模型組和地塞米松組比較有顯著差異（P＜0.05），照后60天至照后120天SPB表達(dá)仍明顯高于模型組和地塞米松組（OD值，P＜0.05），肺泡Ⅱ型細(xì)胞的異常增生不明顯，且肺泡壁仍可見較多的正常肺泡Ⅱ型細(xì)胞分布。
　　(11)EGCG組照后15天肺組織Nrf-2、HO-1、NQO-1表達(dá)即明顯增高，

27、與正常對照組、模型組和地塞米松組比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（相對光密度值P＞0.05）；照后30天至120天肺組織Nrf-2、HO-1、NQO-1表達(dá)持續(xù)增高并維持在較高水平上，與模型組和地塞米松組比較均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（相對光密度值，P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　(1)EGCG能夠減輕放射性肺損傷早期炎癥反應(yīng)，延緩?fù)砥诜卫w維化發(fā)展；
　　(2)EGCG在抗炎和抗纖維化效果的延續(xù)性上優(yōu)于地塞米松；
　　(3)E

28、GCG能夠降低受照大鼠血清MDA水平，提高SOD活力，改善大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，減輕ROS對肺組織的持續(xù)損傷，充分體現(xiàn)了其抗氧化能力，此性質(zhì)可能是EGCG發(fā)揮保護(hù)作用的主要機(jī)制；
　　(4)EGCG能夠保護(hù)肺泡Ⅱ型細(xì)胞并抑制其異常轉(zhuǎn)化增生，可能與EGCG的抗氧化應(yīng)激性能相關(guān)；EGCG能夠阻滯肺組織肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖，并以此減輕肺纖維化病變；
　　(5)EGCG能夠降低肺損傷大鼠血清炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IFN

29、-γ、TNF-α水平，佐證了其在治療放射性肺損傷過程中有較強(qiáng)的抗炎癥反應(yīng)能力；
　　(6)EGCG可通過激活NrF2-ARE信號途徑，增加Ⅱ相抗氧化酶和解毒酶的表達(dá)和活性，提高受照機(jī)體抗氧化能力，在維持氧化/抗氧化平衡體系發(fā)揮了較大作用。
　　總之，EGCG可以通過清除機(jī)體氧自由基，減少氧自由基過度生成，激活內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激機(jī)制，免疫調(diào)節(jié)等多種分子機(jī)制保護(hù)肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷，改善肺組織炎癥反應(yīng)和纖維化病變，為放射性肺損傷防治提供