大腸桿菌不耐熱腸毒素亞單位的克隆、表達(dá)及A亞單位單克隆抗體的制備.pdf

1、不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin,LT)是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichia coli,ETEC)產(chǎn)生的六聚體蛋白。不耐熱腸毒素除了較強的毒性外，還具有很強的免疫原性以及能夠輔助其他抗原通過粘膜免疫途徑使機體產(chǎn)生特異性抗體，因而它還是良好的粘膜免疫佐劑，在粘膜免疫研究中具有重要價值。 本研究以產(chǎn)不耐熱腸毒素44814株為材料，在產(chǎn)毒培養(yǎng)基CAYE-2培養(yǎng)后，收集的菌

2、液經(jīng)多粘菌素B和超聲波處理，獲得腸毒素粗提物。通過硫酸銨沉淀后，D-Salt Dextran Desalting Column層析脫鹽獲得腸毒素的初步提取物。提取物過濾除菌后，通過健康家兔回腸結(jié)扎試驗和CHO細(xì)胞毒性試驗，證明了所獲得腸毒素的初步提取物能引起家兔回腸腸液蓄積和CHO細(xì)胞形變、死亡，符合不耐熱腸毒素的生物學(xué)特性，表明提取物中含有不耐熱腸毒素，從而為后續(xù)研究提供了檢測抗原。 為了進(jìn)一步了解不耐熱腸毒素的生物學(xué)特性，根

3、據(jù)其已發(fā)表的A、B亞單位結(jié)構(gòu)基因序列，各設(shè)計一對引物，經(jīng)PCR從產(chǎn)腸毒素大腸桿菌44814株分別擴增出LT-A、IX-B結(jié)構(gòu)蛋白基因片段，并分別定向克隆入pGEX-6P-1質(zhì)粒載體，分別獲得重組質(zhì)粒pGEX-LXA和pGEX-LTB。重組菌裂解物的SDS-PAGE及Western-blot分析證明，含有重組質(zhì)粒pGEX-LTA的大腸桿菌BL21能夠表達(dá)分子量約為56ku的融合蛋白GST-LTA，含有重組質(zhì)粒pGEX-LTB的大腸桿菌BL

4、21能夠表達(dá)分子量約為39ku的融合蛋白GST-LXB，從而為研制LT的單克隆抗體提供了抗原。 單克隆抗體作為一種良好的檢測試劑，具有較強的特異性。本研究利用初步提純A亞單位的表達(dá)產(chǎn)物作為免疫原免疫6周齡BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，用間接ELISA檢測，經(jīng)三次亞克隆得到了穩(wěn)定分泌抗LTA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株F8和G9，制備了腹水，并利用該單抗初步建立了間接ELISA和Dot-ELISA等特異性檢測