體外擴(kuò)增臍血巨核細(xì)胞的生物學(xué)特性及其體內(nèi)功能的研究.pdf

1、目的：造血干細(xì)胞移植目前已經(jīng)成為治療多種惡性疾病的有效方法之一，臍血因具有移植物抗宿主病發(fā)生率低的優(yōu)點(diǎn)，成為造血干細(xì)胞的主要來(lái)源。但是，有兩大因素阻礙了臍血造血干細(xì)胞的廣泛應(yīng)用。一是臍血中所含的造血干/祖細(xì)胞數(shù)目少，不能滿足移植的需要，尤其是對(duì)一些難治性的血液系統(tǒng)疾病，如范可尼貧血、慢性髓系白血病和重型再生障礙性貧血。二是臍血移植同骨髓和外周血移植相比其植入速度慢，尤其是血小板的恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，持續(xù)的血小板減少不僅會(huì)增加患者出血死亡的可能

2、性，而且反復(fù)的血小板輸注易導(dǎo)致血小板無(wú)效輸注及病毒感染機(jī)會(huì)增加等一系列問(wèn)題，成為困擾臨床的一大難題。臍血中含有大量的干/祖細(xì)胞，具有擴(kuò)增、分化的潛能，因此取出部分的臍血進(jìn)行巨核系祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增及適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)成熟，然后與未擴(kuò)增部分一并輸注回受者體內(nèi)，從而加速體內(nèi)血小板的恢復(fù)是有望解決這一難題的重要途徑。近年來(lái)大量的研究證實(shí)，多種細(xì)胞因子如Fit-3配體(FL)、血小板生成素(TPO)、干細(xì)胞因子(SCF)、白介素-3(IL-3)等能支持臍

3、血巨核系祖細(xì)胞的定向擴(kuò)增，且效果明顯優(yōu)于骨髓及外周血造血干細(xì)胞。但是，擴(kuò)增后的巨核祖細(xì)胞是否具有體內(nèi)功能，能否向成熟的巨核細(xì)胞分化尚未證實(shí)，而且關(guān)于短期的擴(kuò)增效果尚未涉及。目前已有少數(shù)研究確認(rèn)體外擴(kuò)增后的巨核祖細(xì)胞可以植入非糖尿病/免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠動(dòng)物模型，但關(guān)于移植后的巨核祖細(xì)胞在體內(nèi)分化及成熟的研究尚未見(jiàn)到。本文以臍血CD34+造血干細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用含有TPO、SCF、IL-3、IL-6不同因子組合的無(wú)血清培養(yǎng)體

4、系誘導(dǎo)其向巨核系分化和擴(kuò)增，并對(duì)其植入NOD/SCID小鼠模型后的植入水平進(jìn)行檢測(cè)。 方法：1.臍血CD34+細(xì)胞的分離及體外擴(kuò)增臍血取自健康足月妊娠的胎盤(pán)組織，枸櫞酸鈉抗凝的血袋保存，4-6小時(shí)內(nèi)進(jìn)行CD34+細(xì)胞分離純化。Percol密度梯度離心法收集單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，采用免疫磁珠法，按CD34細(xì)胞分選試劑盒說(shuō)明純化細(xì)胞。將CD34+細(xì)胞接種于含Stem SpanTM SFEM無(wú)血清培養(yǎng)基的24孔板中，加入四種不同細(xì)胞因

5、子。根據(jù)細(xì)胞因子不同組合分為3組(1)TPO+SCF+HL-3+IL-6組；(2)TPO+SCF+IL-3組；(3)TPO+SCF組。 2.體外擴(kuò)增后臍血巨核細(xì)胞生物學(xué)特性的研究(1)巨核細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)收集第3、7、10、14天的細(xì)胞，熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志CD42b、CD41a、CD61和粘附因子標(biāo)志CD49d、CD49e、CD11a、CD54的表達(dá)。 (2)巨核細(xì)胞凋亡的檢測(cè)擴(kuò)增后的細(xì)胞用Annexin WF

6、ITC和碘化丙錠(PI)溶液處理后，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。 (3)巨核細(xì)胞形成單位(CFU-Mk)檢測(cè)將細(xì)胞接種于含人甲基纖維素培養(yǎng)基的24孔板中，在37℃、5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，進(jìn)行CFU-GM集落計(jì)數(shù)，培養(yǎng)前后進(jìn)行對(duì)比。 (4)多倍體巨核細(xì)胞的檢測(cè)擴(kuò)增后的細(xì)胞用含有核糖核酸酶(RNase)的碘化丙啶(PI)緩沖液進(jìn)行處理后，使DNA染色，在流式細(xì)胞儀上對(duì)CD41+細(xì)胞進(jìn)行多倍體檢測(cè)。 (5)巨核細(xì)胞特異

7、性基因的表達(dá)按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis試劑盒說(shuō)明合成cDNA。用熒光定量PCR鑒定基因β-actin、APAF-1、GATA-1、NF-E2、HPRT、GPIIb、TXS的表達(dá)。 3.體內(nèi)功能檢泐(1)體外擴(kuò)增的巨核細(xì)胞移植入NOD/SCID小鼠16只6-8周的NOD/SICD小鼠無(wú)菌條件下飼養(yǎng)，分為4組，經(jīng)亞致死量放射線(350 cGy)全身照，4-6h內(nèi)將細(xì)胞尾靜脈注入照

8、射后的小鼠體內(nèi)。(1)實(shí)驗(yàn)組I：TPO+SCF+IL-3+IL-6擴(kuò)增7-10天的細(xì)胞。(1)實(shí)驗(yàn)組II：TPO+SCF擴(kuò)增7-10天的細(xì)胞。(3)陽(yáng)性對(duì)照組：同等數(shù)量的CD34+細(xì)胞。(4)陰性對(duì)照組：同等體積的生理鹽水。 (2)小鼠骨髓的檢測(cè)小鼠處死后無(wú)菌條件下取小鼠的股骨與脛骨骨髓細(xì)胞，熒光顯微鏡檢測(cè)人巨核細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD41、CD45的表達(dá)。 (3)小鼠外周血中人血小板的檢測(cè)小鼠處死后心臟取血，熒光顯微

9、鏡檢測(cè)鼠源性和人源性抗體CD41的表達(dá)。 結(jié)果：1.分離獲得的CD34+細(xì)胞在體外可以有效擴(kuò)增，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的原始巨核細(xì)胞(CD34+/CD41+)均在第7天達(dá)最高值，且添加IL-3和IL-6的細(xì)胞因子組合優(yōu)于未添加組；三個(gè)實(shí)驗(yàn)組CD41+、CD42b+、CD61+細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸增高，三組之間有顯著性差異。粘附因子CD49d+、CD11a+、CD49e+的表達(dá)均在培養(yǎng)第7天達(dá)到最高水平，而CD54+的表達(dá)

10、量呈下降趨勢(shì)。 2.SCF、TPO組合在擴(kuò)增第7天并不能顯著抑制細(xì)胞凋亡，加入IL-3和IL-6后，Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞由(8.264±2.49)％降至(3.51±1.24)％。CFU-MK的數(shù)量在第10天時(shí)最高，且8倍體及8倍體以上的巨核細(xì)胞所占的的百分比增加，即成熟產(chǎn)板型巨核細(xì)胞增加。熒光定量PCR測(cè)定GATA-1、NF-E2、GPIIb的相對(duì)表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)I組第7天水平最高，GATA-1、GPIIb的相對(duì)表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)I

11、I組第7天達(dá)到最高水平而NF-E2在第10天降到最低之后逐漸回升，凋亡轉(zhuǎn)錄因子APAF-1的相對(duì)表達(dá)逐漸增多，實(shí)驗(yàn)III組GATA-1、NF-E2、GPIIb的相對(duì)表達(dá)量在第10天達(dá)到水平之后下降，TXS、HPRT的測(cè)定基本通NF-E2。 3.移植入NOD/SCID小鼠體內(nèi)后，1周后小鼠骨髓均有人臍血細(xì)胞植入，CD45的表達(dá)量在兩實(shí)驗(yàn)組小鼠的骨髓中為(5.47±1.76)％、(6.63±0.57)％，CD41+細(xì)胞為(1.70±

12、0.17)％、(2.21±0.31)％。小鼠外周血中人血小板在移植后3天就可測(cè)到，兩實(shí)驗(yàn)組分別再第7天和14天達(dá)到高水平(為20.46％和24.37％)。 結(jié)論：1．三種因子組合TPO+SCF+IL-3+IL-6、TPO+SCF+IL-3和TPO+SCF在體外均可使臍血巨核細(xì)胞有效擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增后巨核細(xì)胞的生物學(xué)特性的鑒定，認(rèn)為因子組合TPO+SCF+IL-3+IL-6在第7-10天的擴(kuò)增效率最高。 2.將擴(kuò)增后的臍血