HIF-1α及MDR1 miRNA重組慢病毒干擾體系逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞多藥耐藥的研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文HIF1α及MDR1miRNA重組慢病毒干擾體系逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞多藥耐藥的研究姓名：丁震宇申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：梁后杰20080501第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文方法1、通過(guò)免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光雙標(biāo)染色技術(shù)觀察結(jié)腸癌組織標(biāo)本中HIF一10【與P—gP的表達(dá)和分布情況，了解二者在結(jié)腸癌組織中表達(dá)的關(guān)系及與腫瘤分期、淋巴轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的關(guān)系。2、采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色及RTPCR技術(shù)分別在常氧及低

2、氧培養(yǎng)條件下檢測(cè)四種結(jié)腸癌細(xì)胞株中HIF一10t與MDRl／P—gP的表達(dá)變化情況，初步探討腫瘤低氧微環(huán)境對(duì)HIF—la及MDRl／P—gP表達(dá)的影響及二者表達(dá)的變化關(guān)系。3、設(shè)計(jì)合成分別針對(duì)靶基因HIF一1q與MDRl的各2組pre—miRNA干擾序列，構(gòu)建帶有報(bào)告基因EmGFP的pcDNATM62一GW／EmGFP—miR—HIF一10【及pcDNATM62一GW／EmGFP—miR—MDRl兩套干擾質(zhì)粒，雙酶切及測(cè)序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成

3、功后，應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineⅢ2000分別介導(dǎo)兩套miR干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞，經(jīng)殺稻瘟菌素篩選穩(wěn)定陽(yáng)性克隆，利用半定量RTPCR技術(shù)檢測(cè)兩種干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后相應(yīng)目的基因mRNA表達(dá)抑制情況，分析其干擾效果及兩種靶基因可能的作用關(guān)系，從而在備選的4組pre—miRRNA干擾序列中挑選出分別針對(duì)靶基因HIF一10t與MDRl干擾效果最佳的1組進(jìn)行下游miR慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建。4、選取上一部分鑒定出的干擾效果最佳的兩組miR

4、干擾質(zhì)粒，應(yīng)用Gateway重組反應(yīng)技術(shù)構(gòu)建分別針對(duì)靶基因HIF一10t與MDRl的兩套miR慢病毒表達(dá)克隆pLenti6／V5一GW／EmGFP—miR—HIF一1u與pLenti6／V5一GW／EmGFP—miRMDR1，應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine。M2000介導(dǎo)法，共轉(zhuǎn)染ViraPowerTM混和慢病毒包裝質(zhì)粒體系入293FT細(xì)胞產(chǎn)毒，產(chǎn)毒上清經(jīng)感染NIH／3T3細(xì)胞進(jìn)行滴度測(cè)定。而后將HIF1a與MDRl兩套miR重組

5、慢病毒干擾體系分別感染LoVo細(xì)胞，經(jīng)殺稻瘟菌素穩(wěn)定篩選后，利用半定量RTPCR及Westernblot技術(shù)分別檢測(cè)干擾后HIF一10t與MDRl基因mRNA及蛋白的表達(dá)變化情況，并進(jìn)一步在蛋白水平分析兩種基因可能存在的作用關(guān)系。5、采用三維培養(yǎng)的方法分別建立穩(wěn)定感染HIF一1Q或MDRlmiR重組慢病毒及親本LoVo細(xì)胞的多細(xì)胞球(MCS)培養(yǎng)體系，經(jīng)低氧培養(yǎng)處理，模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞微環(huán)境，以建立體外經(jīng)低氧誘導(dǎo)的LoVoMCS耐藥模型，