A型流感病毒誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡研究.pdf

1、背景及目的：
　　流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病,其起病急,蔓延快,對人群尤其是兒童、老年人及免疫缺陷者造成很大的危害。流感病毒點(diǎn)突變造成的抗原漂移可導(dǎo)致流感每年季節(jié)性流行,而基因重配造成的抗原轉(zhuǎn)換則可能產(chǎn)生新的亞型,因人類對新亞型普遍缺乏免疫力而可能導(dǎo)致流感世界大流行。
　　流感病毒已被證明能誘導(dǎo)各組織細(xì)胞的凋亡,包括外周血單個(gè)核細(xì)胞。已經(jīng)證明:從小鼠中分離得到的淋巴細(xì)胞能被從人身上分離得到的高致病A型流感病

2、毒所誘導(dǎo),而導(dǎo)致凋亡的發(fā)生,但流感病毒誘導(dǎo)其凋亡的相關(guān)免疫病理學(xué)機(jī)制并沒得到進(jìn)一步的闡述。研究表明,在病毒感染細(xì)胞時(shí),病毒自身蛋白以及細(xì)胞分泌的信號分子都參與到這一過程中,比如,FAS-FASL、腫瘤壞死因子(TNF),RNA依賴的蛋白激酶R(PKR),氧化亞氮,轉(zhuǎn)化生長因子(TGF),有絲分裂原激活蛋白(MAP)激酶。盡管許多蛋白被證明與流感病毒的凋亡有關(guān),但并沒有一個(gè)統(tǒng)一的理論來概括各種因素。
　　在許多生理過程中,凋亡都是自

3、發(fā)產(chǎn)生的,比如組織萎縮,免疫系統(tǒng)的發(fā)育等等。同樣的,凋亡在許多傳染性疾病的病理變化過程中也扮演著重要的角色,比如由病毒所引起的感染,盡管有許多的細(xì)胞內(nèi)蛋白牽涉到這一過程,但腫瘤抑制蛋白P53作為一種調(diào)節(jié)性蛋白,在腫瘤抑制、凋亡的調(diào)控、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)上都起著重要的作用。P53還是各種外界應(yīng)急壓力下抑制異常細(xì)胞過度生長的主要組分之一。各種細(xì)胞外界壓力,包括病毒感染,藥物處理等,均能激活P53的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯或發(fā)生凋亡。P53的調(diào)

4、節(jié)作用主要通過對蛋白磷酸化機(jī)制的穩(wěn)定,增強(qiáng)核定位,改變構(gòu)象,增強(qiáng) DNA的結(jié)合等幾個(gè)方面來起作用。
　　本實(shí)驗(yàn)選用各不同健康人的外周血,從中分離得到淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞,并用H1N1 A型流感病毒感染,通過流式PI單染色以及Annexin V-PI雙染色檢測并比較外周血淋巴細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞在不同情況下的凋亡情況。RT-PCR分別檢測P53,IFN的RNA表達(dá)水平。根據(jù)檢測的結(jié)果,加入了Pifithrin-α(PFT-α)抑制

5、P53轉(zhuǎn)錄,檢測P53被抑制時(shí),外周血淋巴細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞的凋亡情況。
　　材料與方法：
　　選取由本實(shí)驗(yàn)室提供的A型流感病毒A/Shantou/169/2006(H1N1)1株,選用流感病毒分離鑒定細(xì)胞系MDCK(Madin-Darby canine kidney)細(xì)胞,通過紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(Hemagglutination assay, HA)、空斑形成試驗(yàn)(Plaque-forming assay),得到空斑形成單位

6、(Plaque forming unit, PFU)為1.2×107 PFU/ml的病毒液。采集志愿者的新鮮血液并于1h內(nèi)用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離并得到單個(gè)核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞。用病毒液吸附不同處理方式的細(xì)胞:包括1.病毒直接吸附單個(gè)核細(xì)胞;2.病毒直接吸附淋巴細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞1h后,再將淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞進(jìn)行分離;3.將淋巴細(xì)胞,單核巨噬細(xì)胞進(jìn)行分離后再用流感病毒進(jìn)行吸附;4.病毒吸附不同時(shí)間后,淋巴細(xì)胞、

7、單核巨噬細(xì)胞的凋亡情況。控制感染復(fù)數(shù)( Multiplicity of infection, MOI)為2。并使用流式細(xì)胞術(shù),通過碘化丙錠(Propiolium, PI)單染色和Annexin V-PI雙染色的方法檢測細(xì)胞的凋亡,以確認(rèn)不同處理間凋亡是否存在差異。同時(shí),提取病毒感染后培養(yǎng)2h,4h,8h,12h淋巴細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞的RNA,檢測淋巴細(xì)胞,單核巨噬細(xì)胞中P53,IFN在RNA表達(dá)水平上的差異。根據(jù)PCR結(jié)果,使用Pif

8、ithrin-α(PFT-α)抑制P53的轉(zhuǎn)錄,并通過流式PI單染色檢測淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.所取H1N1 A型流感病毒在MDCK中進(jìn)行培養(yǎng)后,滴度有所下降,滴度從512下降到培養(yǎng)后的256.
　　2.空斑形成試驗(yàn):PFU=1.2×107 PFU/ml
　　3. PI染色結(jié)果:淋巴細(xì)胞在病毒的作用下凋亡率逐漸增加,但同時(shí)隨著淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間的延長,淋巴細(xì)胞自身出現(xiàn)的凋亡也逐漸

9、增加。在24h,加入流感病毒的單核巨噬細(xì)胞其凋亡較未加入病毒的對照組要高,而從48h開始,加入病毒的單核巨噬細(xì)胞其凋亡則反較對照組要低。Annexin V-PI雙染色結(jié)果與PI單染色結(jié)果一致。
　　4.將淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞用流感病毒吸附1h后再進(jìn)行分離與淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞分離后再進(jìn)行病毒吸附1h,培養(yǎng)48h后分別進(jìn)行凋亡檢測,其中淋巴細(xì)胞凋亡比例前者較后者要低。
　　5.熒光染色結(jié)果:流感病毒分別吸附1h,2h,4h

10、,8h,培養(yǎng)48h后,各凋亡比例間不存在差異。
　　6. RT-PCR結(jié)果:淋巴細(xì)胞在2h,4h,P53表達(dá)水平均升高,對照組在8h,P53仍有少量表達(dá)。單核巨噬細(xì)胞在4h后,病毒感染組,其P53表達(dá)水平要明顯升高。IFN RT-PCR結(jié)果無差異。
　　7.加入抑制劑PFT-α后PI染色:淋巴細(xì)胞,單核巨噬細(xì)胞凋亡峰均消失,凋亡被抑制。
　　結(jié)論：
　　1.流感病毒分別感染單個(gè)核細(xì)胞,淋巴細(xì)胞,單核巨噬細(xì)胞,其各

11、自的凋亡比例之間的差異顯示了在流感病毒誘導(dǎo)的凋亡中,淋巴細(xì)胞與單核巨噬細(xì)胞之間是存在相互作用的。
　　2.流感病毒在細(xì)胞中吸附不同時(shí)間后,檢測細(xì)胞凋亡情況,說明凋亡與流感病毒吸附時(shí)間的長短不存在相關(guān)性。
　　3.流感病毒能夠誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡,而對單核巨噬細(xì)胞,病毒吸附后,培養(yǎng)48h前表現(xiàn)為誘導(dǎo)凋亡,培養(yǎng)48h后則表現(xiàn)為抑制凋亡,在不同的時(shí)間段表現(xiàn)為不同的效果。
　　4.通過對IFN,P53 RNA水平的檢測結(jié)果,說明流