應(yīng)用血小板蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選ITP患兒血小板蛋白標(biāo)志物.pdf

1、研究背景與目的：免疫性血小板減少癥(ITP)是一種免疫介導(dǎo)的血小板減少綜合征，是兒童最為常見(jiàn)的出血性疾病。迄今，ITP的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，ITP時(shí)血小板功能究竟如何、血小板是否處于激活狀態(tài)等，目前并無(wú)定論。目前對(duì)ITP的診斷依然是“排除診斷法”，臨床上診斷主要靠外周血小板減少但其無(wú)特異性；抗血小板自身抗體(PAIgG)的檢測(cè)對(duì)于ITP的診斷有限，盡管對(duì)其檢測(cè)的敏感性和特異性有所提高，但仍然無(wú)法將“原發(fā)免疫性血小板減少癥”與“繼發(fā)性免

2、疫性血小板減少癥”區(qū)分開(kāi)來(lái)。因此，以血小板為基礎(chǔ)，研究血小板表達(dá)的特殊蛋白質(zhì)，分析其功能變化在ITP發(fā)病中的作用，對(duì)闡明ITP的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface enhanced laser desorption/ionization-time offlight-mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的一種蛋白組學(xué)研究方法。它可對(duì)血清、細(xì)胞裂解液等生物樣品直

3、接進(jìn)行檢測(cè)，能基本反映被檢樣本中蛋白質(zhì)的全貌，進(jìn)而可以發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的變化，為早期診斷、預(yù)后估計(jì)、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的監(jiān)測(cè)提供了可能。本研究旨在利用Ciphergen公司的蛋白質(zhì)芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜儀系統(tǒng)結(jié)合蛋白芯片對(duì)ITP，ITP治療組及正常患兒血小板差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析，篩選與ITP相關(guān)的血小板蛋白質(zhì)標(biāo)志物，在血小板蛋白質(zhì)組水平探討ITP的發(fā)病機(jī)制。探討建立可用于ITP早期診斷的分類(lèi)模型。
　　方法：采用SELDI(surface enhan

4、ced laser desorption/ionization，SELDI)蛋白芯片技術(shù)，檢測(cè)40例ITP患兒、40例ITP治療組患兒及35例正常兒童血小板進(jìn)而獲得血小板蛋白質(zhì)圖譜圖，將獲得的蛋白質(zhì)譜圖用Ciphergen公司的Biomarker Wizard和Biomarker Pattern軟件分析，通過(guò)交叉驗(yàn)證建立起ITP早期診斷的分類(lèi)樹(shù)模型，并另將含有40例ITP患兒和35例正常兒童的驗(yàn)證組共75例對(duì)此模型進(jìn)行盲法驗(yàn)證。蛋白質(zhì)組

5、數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)差異蛋白，篩選與ITP相關(guān)的血小板蛋白質(zhì)。
　　結(jié)果：1，在分子質(zhì)量/電荷比值(質(zhì)荷比，mass electron ratio，M/Z)為2000-20000范圍內(nèi)，對(duì)40例ITP患兒及35例正常兒童血小板蛋白進(jìn)行分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有22個(gè)蛋白表達(dá)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，1個(gè)蛋白峰表達(dá)上調(diào)，21個(gè)蛋白峰表達(dá)下調(diào)，篩選出的22個(gè)差異蛋白質(zhì)峰經(jīng)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的初步鑒定，這些蛋白可能與血小板蛋白質(zhì)的生成與翻譯，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄

6、的調(diào)控，免疫調(diào)控，免疫應(yīng)答，抗凝及細(xì)胞之間的調(diào)節(jié)等有關(guān)。它們分別為磷酯酰絲氨酸脫羧酶α鏈，50S核糖體L34，內(nèi)分泌蛋白質(zhì)VGF，假定未知編碼蛋白MIR22HG，Humanin-Iike蛋白質(zhì)5，β-防衛(wèi)素110，乳粘素，尿激酶Ⅰ型纖溶酶原激活物，P3(42)，人C13orf3(SKA3)，緊密連接關(guān)聯(lián)蛋白1，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白CD24，核膜孔蛋白-62 C末端樣蛋白。另外亦有9個(gè)蛋白質(zhì)峰在數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定結(jié)果為unnamed。2，在篩選出的22

7、個(gè)差異蛋白峰中，以質(zhì)荷比為5170.65、7672.06 m/z、3553.70m/z、2281.72 m/z的蛋白質(zhì)峰差異最明顯，以此建立的分類(lèi)樹(shù)診斷模型，其準(zhǔn)確率、靈敏度及特異度為96％(72/75)、100％(40/40)和92.5％(32/35)。將包括ITP患兒40例和35例正常兒童的驗(yàn)證組對(duì)此模型進(jìn)行盲法驗(yàn)證，結(jié)果該模型診斷ITP的準(zhǔn)確率、靈敏度及特異度分別是95％(71/75)、96％(38/40)和94％(33/35)。