人偏肺病毒部分基因克隆及蛋白表達.pdf

1、[目的]
　　 1.建立hMPV的分子生物學篩查技術平臺。
　　 2.直接從臨床標本中運用長片段RT-PCR方法構建人偏肺病毒基因組亞克隆并進行核酸序列測定，探討影響長RT-PCR的因素，為全基因克隆打下基礎，以便進一步了解其生物學特征。
　　 3.原核表達結合蛋白N及附加糖蛋白G，為臨床抗體檢測及預防提供基礎資料。
　　 4.初步了解深汕地區(qū)hMPV所致小兒呼吸道感染的特點，為快速診斷及治療提供依據(jù)。<

2、br>　　 [方法]
　　 1.標本采集與處理
　　 收集我院及汕頭大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院2008年10月-2010年6月14歲以下呼吸道感染住院患兒咽拭子1137例，將采集的標本置于3ml病毒保護液中，-80℃保存。
　　 2.引物設計
　　 通過查閱文獻，在GenBank中找到hMPV的全基因序列，利用Mega4.1Beta生物學分析軟件找到其保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)基因序列，使用Primer5.0和Ol

3、igo6.0軟件設計篩查、克隆引物并根據(jù)蛋白編碼序列位參考，在5’端引入酶切位點，設計核蛋白N及附加糖蛋白G擴增引物。
　　 3.hMPV篩查
　　 根據(jù)本實驗室已建立的呼吸道病毒RT-PCR擴增體系及已確定為hMPV陽性的標本株作為陽性對照進行hMPV的篩查。
　　 4.hMPV的基因克隆
　　 運用長片段RT-PCR技術擴增克隆基因片段，切割含目的條帶的凝膠進行純化，并將目的片段連接到PJET1.2/

4、blunt克隆載體，轉化感受態(tài)細胞TOP10，經(jīng)含氨芐青霉素的抗生素平板篩選，得到陽性克隆，提取質(zhì)粒，最后對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定和測序鑒定。
　　 5.hMPV的蛋白表達
　　 以hMPV陽性標本核酸為模板，擴增G、N基因片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ消化后，連入表達載體PRSET-A，轉化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導，表達以his為標簽的目的蛋白。
　　 [結果]
　　 1.建立了篩查

5、技術平臺。在1137份咽拭子標本中，hMPV的檢出率為4.49％(51/1137)，男女比例為27:24，3歲及3歲以下患兒占陽性檢出率的80.4％。51例hMPV陽性病例中與其他病毒的混合感染率為56.86％(29/51)，其中混合感染率最高的是RSV和IVA，其次是RHV。陽性患兒的臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、喘息等呼吸道感染癥狀，少部分伴有胃腸道癥狀或抽搐。臨床診斷主要為支氣管肺炎(24例，其中三例合并高熱驚厥，1例合并診斷為全

6、身炎癥反應綜合征)，喘息型肺炎(17例，1例合并腸炎)，毛細支氣管炎(9例，1例合并腸炎)，上呼吸道感染(1例)。
　　 2.本實驗建立的長片段RT-PCR方法，通過對各種影響因素的調(diào)整，包括退火溫度、緩沖液的濃度、酶、引物的濃度等，能較穩(wěn)定的擴增出目的條帶。
　　 3.將本實驗所得5株hMPV亞克隆基因片段與NCBI已經(jīng)公布的國內(nèi)外基因序列進行核酸序列比較分析，發(fā)現(xiàn)DNA同源性大于85％，但相互之間變異則較大，尤其是克

7、隆片段2之間的變異最大，同源性小于30％。
　　 4.擴增目的蛋白G、N基因片段，雙酶切后連入表達載體，轉化BL21，經(jīng)IPTG誘導，成功表達了以his為標簽的目的蛋白。
　　 [結論]
　　 1.本研究共篩查了呼吸道標本1137例，其中hMPV陽性標本51例，檢出率4.49％，感染患兒集中在3歲及以下，最常合并感染RSV和IVA，感染高峰主要是2、3、4、5月，這可能是hMPV在深汕地區(qū)的感染特點，也證實hMP