三株新城疫病毒抗人喉癌作用的比較研究.pdf

1、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)屬副黏病毒科(Paramyxoviridae)腮腺炎病毒屬(Paramyxovirus)成員，對禽類具有高度的致病性，在極少數情況下可以感染人類，表現(xiàn)為輕微的結膜炎或溫和的呼吸道癥狀[1]。研究發(fā)現(xiàn)，NDV在人類腫瘤細胞中的復制效率是在正常細胞中的10000倍[2]，這使得人們將它作為潛在的抗癌生物制劑[3]。目前，NDV治療腫瘤已經成為一種輔助及另類醫(yī)療方法(Comp

2、lementary and altemative medicine，CAM)用于人類癌癥的治療，并已被廣泛的研究[4]。 本研究通過MTT法、HE染色法、電鏡觀察法、免疫組化法、流式細胞儀技術等實驗方法，比較研究NDV D817株、NDV7793株和NDV La Sota疫苗株體外對人喉癌Hep-2細胞及體內對人喉癌Hep-2細胞裸鼠皮下移植瘤的抑制效應，同時將這3株NDV作用于人喉部正常組織細胞以對它們的安全性進行比較。

3、 材料和方法： 選取分離自香港的NDV D817株和江西鄱陽的NDV7793株各1株及1株La Sota疫苗株，接種雞胚以擴增病毒，48h后收取雞胚尿囊液，測定血凝效價≥1:1024后，調整病毒濃度至1×108 PFU/ml，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩３Ｒ?guī)方法培養(yǎng)非洲綠猴腎細胞Vero-E6、人喉癌Hep-2細胞和人喉部正常組織細胞。將3株NDV病毒接種人喉癌Hep-2細胞進行選擇性擴增，并用Vero-E6細胞進行蝕斑純化。得到純

4、化病毒后再次擴增，檢測其HA效價，并用MTT法檢測3株病毒對人喉癌Hep-2細胞及人喉部正常組織細胞的殺傷作用。 將處于對數生長期的Hep-2細胞用含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液消化，收集并調整細胞密度為5×107個/ml的細胞懸液備用。每只裸鼠取1個注射點，用上述細胞懸液0.2ml/只注射于裸鼠皮下，接種后每天觀察有無腫瘤形成及注射點有無破潰紅腫，當腫瘤長徑和短徑均達5mm后進行隨機分組。通過醛化紅細胞法收集尿囊

5、液中的病毒顆粒，PBS稀釋至1×107PFU/ml作為NDV注射液，實驗組每只裸鼠瘤內注射0.1ml。按規(guī)定時間測量腫瘤體積大小及裸鼠體重，繪制腫瘤生長曲線。NDV注射6周后處死裸鼠，秤量瘤塊和脾臟重量，計算抑瘤率和脾臟指數，進行毒性評價。腫瘤組織用10％的福爾馬林溶液固定，進行HE染色，評價移植瘤細胞在光學顯微鏡下的病理變化；通過電鏡觀察移植瘤細胞的病理變化；通過流式細胞儀檢測移植瘤細胞的凋亡情況；通過免疫組化S-P兩步法檢測移植瘤中

6、Bax和Bcl-2蛋白的表達情況。 結果： 本研究選用的3株NDV在體外均能在人喉癌Hep-2細胞中復制增殖，均能殺傷Hep-2細胞，而且殺傷效應與病毒的作用劑量及作用時間成正比。在采用MTT法檢測3株NDV對人喉癌Hep-2細胞及人喉部正常組織細胞的殺傷作用實驗中，3株NDV殺傷腫瘤細胞作用均較強。當病毒稀釋度為1×10-1時，NDV作用細胞60h后NDV D817株、NDV7793株和NDV La Sota株的殺傷率

7、分別為96.65％、94.95％和95.35％;3株NDV對人喉部正常組織細胞影響相對較小(60h殺傷率≤25％)，差異具有統(tǒng)計學意義。72h后3株NDV的殺傷作用均出現(xiàn)不同程度的下降現(xiàn)象。在純化后病毒的蝕斑實驗中，從3株NDV蝕斑出現(xiàn)的時間及PFU數量來看，NDV D817株出現(xiàn)蝕斑的時間最早，蝕斑數量最多，NDV7793株出現(xiàn)蝕斑的時間最晚，蝕斑數量最少，NDV La Sota株居中。 為了盡可能如實的評價3株NDV對腫瘤的

8、抑制增殖作用，本研究II期實驗通過建立裸鼠移植瘤模型，從體內角度來研究3株NDV對人喉癌Hep-2細胞增殖的影響。裸鼠在接種Hep-2細胞后平均約4d后在接種部位可見瘤塊生長，接種12d后腫瘤長徑(L)和短徑(W)均可達5mm，移植瘤成瘤率為100％。在治療過程中，治療初各組腫瘤體積為：PBS陰性對照組平均腫瘤體積為(183.5±15.2)mm3，NDV D817組平均腫瘤體積為(175.4±19.4)mm3，NDV7793組平均腫瘤體

9、積為(176.9±18.7)mm3，NDV La Sota組平均腫瘤體積為(185.4±20.4)mm3，順鉑陽性對照組平均腫瘤體積為(168.5±21.5)mm3，各實驗組間腫瘤體積無顯著性差異。治療期間腫瘤體積逐漸增長，其中PBS陰性對照組增長速度最快，順鉑陽性對照組最慢，NDV組居中。治療末，NDV組和順鉑陽性對照組腫瘤體積顯著低于PBS陰性對照組(P<0.01)。治療結束后剝取腫瘤組織稱重，NDV D817組、NDV7793組、

10、NDV La Sota組和順鉑陽性對照組的抑瘤率分別為56.7％、51.2％、39.4％和90.4％。 在裸鼠移植瘤治療的毒性實驗中，PBS陰性對照組和NDV實驗組裸鼠體重治療后較治療前稍有下降，治療后體重/治療前體重>0.8，差別無統(tǒng)計學意義；順鉑陽性對照組裸鼠治療后體重與治療前相比有顯著性降低(P<0.01)，治療后體重/治療前體重<0.8，差別具有統(tǒng)計學意義，同時該組裸鼠隨著治療的進行活動力出現(xiàn)明顯下降。在對荷瘤裸鼠臟器的

11、影響方面，NDV實驗組裸鼠的脾臟重量和脾臟指數與PBS陰性對照組相比，無顯著性差異。順鉑陽性對照組的脾臟重量和脾臟指數顯著低于PBS陰性對照組(P<0.01)，差別具有統(tǒng)計學意義。取NDV實驗組裸鼠肝臟切片觀察，結果未發(fā)現(xiàn)有明顯的病理變化。 實驗中通過對裸鼠腫瘤組織病理切片的觀察，發(fā)現(xiàn)NDV D817組腫瘤組織與PBS陰性對照組相比有較多的死亡區(qū)域：細胞體積變小、變圓，與臨近細胞脫離。高倍鏡下可見細胞膜突起，呈發(fā)泡狀，核膜裂解，

12、核仁消失。與順鉑陽性對照組相比，細胞破碎現(xiàn)象不明顯。流式細胞術分析檢測顯示，經NDV處理后，移植瘤細胞周期處于G0/G1期細胞含量降低，S期細胞數減少，而G2/M期細胞則增加(P<0.01)，表明細胞周期被阻滯于G2/M期。免疫組化檢測裸鼠皮下移植瘤細胞Bax、Bcl-2蛋白的表達情況，顯示NDV7793組和NDV La Sota組瘤細胞胞質棕黃色較PBS陰性對照組深，Bax蛋白表達率顯著高于PBS陰性對照組，差別具有統(tǒng)計學意義(P<0

13、.01)。NDV7793組和NDV La Sota組Bcl-2蛋白的表達率與PBS陰性對照組相比，無顯著性差異。 結論： 1、實驗所選3株NDV具有選擇性在人喉癌Hep-2細胞中復制增殖和殺傷癌細胞的作用，具備抗腫瘤生物治療的潛能。其中NDV D817株具有較強的抗腫瘤效應，NDV7793株和NDV La Sota株的抗腫瘤作用略低。 2、3株NDV病毒株均對人喉癌Hep-2細胞裸鼠皮下移植瘤有明顯的抑制作用。