農桿菌介導小麥成熟胚遺傳轉化體系的建立及轉抗蟲基因小麥分析.pdf

1、小麥是重要的糧食作物，利用植物基因工程技術進行小麥遺傳改良，增強小麥抗病蟲和耐逆境能力，提高產量，改善品質，是小麥遺傳育種的一個新的方向。本研究以27份優(yōu)良普通小麥(TriticumaestivumL.)主栽品種或高代育種品系，以及4份二倍體和四倍體小麥為試材，進行成熟胚愈傷組織誘導及分化再生的培養(yǎng)，比較其誘導及分化再生能力，研究影響愈傷組織形成及分化再生的因素(基因型、誘愈方式、2,4-D、ABA及KT濃度等)，篩選小麥成熟胚愈傷組織

2、誘導及分化再生能力強的基因型，建立小麥成熟胚植株再生體系。對篩選出來的適合小麥成熟胚組織培養(yǎng)的基因型，利用建立的成熟胚植株再生體系，采用農桿菌(GV3101/pBI121：：gus)介導對小麥成熟胚及愈傷組織進行遺傳轉化，并對影響遺傳轉化效率的因素(轉化受體的基因型、負壓處理、侵染菌液的濃度、外植體預培養(yǎng)時間、侵染時間等)進行研究，確定選擇劑的選擇壓力。同時，對以本實驗室選育的小麥優(yōu)良品系山農995604的胚性愈傷組織為材料，采用農桿菌

3、介導將抗蟲基因豇豆胰蛋白酶抑制劑基因CpTI轉入小麥培養(yǎng)細胞，經篩選獲得的抗卡那霉素再生植株，進行PCR和實時PCR以及PCR-Southern和Southernblot檢測，并進行轉化植株后代的CpTI基因遺傳分析和抗蟲鑒定。獲得以下主要結果： 1.小麥的基因型、成熟胚愈傷組織誘導方式、誘愈時的溫度、光照、誘愈培養(yǎng)基2,4-D和ABA濃度及分化培養(yǎng)基KT濃度等，是影響小麥成熟胚愈傷組織形成和分化再生的重要因素。應用剝胚法(em

4、bryo-isolatedmethod，EI)和整粒法(endosperm-supportedmethod，ES)誘導成熟胚愈傷組織，并分別進行分化再生培養(yǎng)，在31份小麥品種(系)中篩選出了愈傷組織誘導率高、質量好、分化再生能力強、成苗率高的12個基因型，確定了每一基因型的最佳誘愈和分化再生途徑，30～35d即可獲得大量再生植株。適合于剝胚誘愈的有TS021(分化培養(yǎng)基為MSF5)、HB188(MSF5)、SN2618(MSF5)、HB

5、215(MSF5)、Yumai54(MSF5)、T9817(MSF5)、T.dicoccum(MSF5)和SN03J102(MSF9)；適合于整粒法的有4072(MSF1)、TS021(MSF3)、Yannong19(MSF3)、HB341(MSF3)、Jinghua1(MSF5)。在此基礎上建立了較為優(yōu)化和快捷的小麥成熟胚愈傷組織誘導及分化再生體系，為小麥遺傳轉化的成功奠定了基礎。 2.接種茵液濃度及侵染時間、外植體預培養(yǎng)時間

6、、負壓處理、轉化受體的基因型等因素，對小麥成熟胚遺傳轉化有較大影響。不同基因型的轉化受體，對相同農桿菌菌株有不同的敏感性；在進行接種侵染時，同時實施適當的負壓處理有助于提高轉化效率；以整粒切割的成熟胚為受體的轉化，效率明顯高于以成熟胚愈傷組織為受體的遺傳轉化；確定了最佳接種菌液濃度及侵染時間和選擇劑的選擇壓力；在短時間(30～35d)內即可獲得轉化苗，最高轉化率可達12.5％。以上研究結果，證明了以成熟胚為外植體源進行小麥遺傳轉化的可行

7、性和有效性，并初步建立了較為優(yōu)化的農桿菌介導的小麥成熟胚遺傳轉化體系。 3.采用農桿菌介導法獲得的3株獨立的抗卡那霉素再生植株經過分子檢測，為轉CpTI基因小麥植株，CpTI基因以單拷貝形式插入到這些轉化小麥基因組的不同位點。3株轉基因小麥正?？捎?，形成轉基因株系。CpTI基因在轉基因小麥T1代中的分離呈多樣性，在轉基因株系T-Ⅰ、T-Ⅲ中CpTI基因按照孟德爾3：1分離比進行遺傳；而在轉基因株系T-Ⅱ中，CpTI基因的遺傳不符

8、合孟德爾規(guī)律?？瓜x試驗表明，3個轉基因株系對儲糧害蟲麥蛾的抗性有很大提高。轉基因株系T-Ⅰ、T-Ⅱ、T-Ⅲ的T1代PCR陽性植株所結實的T2代籽粒及陰性對照非轉基因植株籽粒，蟲蛀率分別為19.77％、21.86％、32.87％和58.27％，每一株系與對照相比都具有極顯著性差異，麥蛾蟲蛀率分別下降了66.07％、62.48％、43.59％。轉基因小麥抗麥蛾能力的增強，極大程度上是由于CpTI基因導入到小麥基因組中的緣故，而非來源于組織培