半夏、掌葉半夏中凝集素蛋白促炎作用及礬制解毒機(jī)理研究.pdf

1、本學(xué)位論文得到國(guó)家自然科學(xué)基金—天南星科有毒中藥凝集素蛋白與毒性的相關(guān)性和炮制的影響(NO.81173549)、國(guó)家自然基金項(xiàng)目——天南星科有毒中藥礬制解毒共性規(guī)律研究(NO.30973939)、國(guó)家“十一五”科技部支撐計(jì)劃課題——復(fù)制法炮制解毒共性技術(shù)和相關(guān)設(shè)備研究(NO.2006BAI09B06-10)的資助。
　　 半夏為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的塊莖，掌葉半夏為天南星科植

2、物掌葉半夏PinelliapedatiectaSchott的干燥塊莖，同科同屬，均為有毒中藥，其毒性主要表現(xiàn)均是對(duì)口腔、咽喉及皮膚粘膜的強(qiáng)烈刺激性。課題組前期研究表明，半夏、掌葉半夏刺激性毒性成分均為具特殊晶型的“毒針晶”，具倒刺、凹槽、可彎曲，具韌性。毒針晶可引起家兔眼結(jié)膜強(qiáng)烈水腫，大鼠足趾腫脹等強(qiáng)烈的炎癥刺激性毒性。研究結(jié)果表明大量細(xì)長(zhǎng)、質(zhì)地柔韌、兩端尖而鋒利的針狀樣晶體可刺入機(jī)體組織，引起刺激疼痛感并產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。毒針晶是一種主要

3、由草酸鈣、蛋白等組成的復(fù)合物。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)半夏及掌葉半夏毒針晶蛋白中均含有凝集素蛋白。并發(fā)現(xiàn)半夏凝集素蛋白可誘導(dǎo)大鼠腹腔中性粒細(xì)胞遷移，引起大鼠足跖腫脹，具有顯著的促炎效應(yīng)，其促炎作用表現(xiàn)與毒針晶引起的炎癥刺激性毒性極為相似。同科同屬的掌葉半夏凝集素是否與半夏凝集素有相似的促炎活性？未見有報(bào)道。且半夏及掌葉半夏凝集素蛋白的促炎效應(yīng)與毒針晶毒性的相關(guān)性研究也不盡深入。
　　 半夏及掌葉半夏因其具顯著的刺激性毒性，臨床上均主要使用

4、其炮制品?！吨袊?guó)藥典》記載半夏炮制品有清半夏、姜半夏及法半夏，其中清半夏及姜半夏均使用相同的輔料白礬；掌葉半夏是臨床天南星的代用品，也大多采用輔料白礬炮制。其他天南星科毒性中藥天南星、白附子在復(fù)制法炮制工藝中均需加入白礬至口嘗稍有或無(wú)麻辣味。課題組前期研究結(jié)果顯示白礬（主要含十二水硫酸鋁鉀）是復(fù)制法減毒的共性炮制輔料，其炮制作用主要是降低其刺激性毒性，故將白礬炮制稱為礬制。白礬溶液可以破壞毒針晶的特殊晶型，使得毒針晶逐漸被銹蝕，推測(cè)其作

5、用可能是白礬溶液中的三價(jià)鋁離子絡(luò)合毒針晶中草酸根離子，使得毒針晶不溶性草酸鈣溶解，針晶剛性支撐的物質(zhì)基礎(chǔ)被破壞，從而毒性降低，但未經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，國(guó)內(nèi)外也未見有報(bào)道。同時(shí)白礬溶液是否對(duì)毒針晶中的化學(xué)刺激物凝集素蛋白產(chǎn)生某種作用導(dǎo)致其化學(xué)刺激性下降，國(guó)內(nèi)外也未有研究。
　　 本學(xué)位論在在本課題組前期對(duì)半夏、掌葉半夏毒性成分和炮制減毒機(jī)理研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以半夏及掌葉半夏的毒性成分毒針晶及凝集素蛋白為研究對(duì)象，深入研究凝集素蛋白促炎作

6、用及其與毒針晶毒性的相關(guān)性，深入研究礬制對(duì)半夏、掌葉半夏毒針晶結(jié)構(gòu)、組成及刺激性的影響，揭示復(fù)制法礬制解毒機(jī)理，主要工作內(nèi)容和研究結(jié)果包括以下幾方面：
　　 1.半夏及掌葉半夏凝集素促炎作用研究
　　 為了進(jìn)一步研究半夏、掌葉半夏凝集素蛋白的促炎作用，采用小鼠腹腔炎癥模型，考察半夏及掌葉半夏凝集素蛋白促炎作用的量-毒效應(yīng)及時(shí)-毒效應(yīng)；采用家兔眼結(jié)膜刺激模型和小鼠腹腔炎癥模型，考察半夏及掌葉半夏凝集素蛋白與毒針晶毒性的相關(guān)

7、性。研究結(jié)果表明：半夏凝集素、掌葉半夏凝集素均可引起大鼠腹腔滲出液中PGE2、蛋白含量顯著提高，并呈劑量依賴性；半夏及掌葉半夏凝集素蛋白均可顯著加重毒針晶對(duì)家兔眼結(jié)膜的刺激性，且隨著凝集素濃度的升高，眼結(jié)膜炎癥腫脹顯著增強(qiáng)，但單給藥凝集素對(duì)家兔眼結(jié)膜無(wú)刺激性。此結(jié)果表明，半夏、掌葉半夏凝集素蛋白具強(qiáng)烈的促炎作用，其促炎作用與毒針晶的刺激性炎癥毒性密切相關(guān)。半夏、掌葉半夏產(chǎn)生強(qiáng)烈炎癥刺激的機(jī)制是毒針晶刺入機(jī)體，凝集素蛋白隨針晶刺入而進(jìn)入機(jī)

8、體組織，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生而產(chǎn)生嚴(yán)重的刺激性毒性。
　　 2.礬制對(duì)半夏、掌葉半夏毒針晶及凝集素蛋白所致炎癥刺激性毒性的影響
　　 采用家兔眼結(jié)膜刺激模型和小鼠腹腔炎癥模型考察礬制對(duì)半夏、掌葉半夏毒針晶及凝集素致炎作用的影響。研究結(jié)果表明：毒針晶經(jīng)8％白礬炮制后可以顯著降低對(duì)家兔眼結(jié)膜的刺激性，半夏及掌葉半夏凝集素蛋白經(jīng)8%白礬炮制后，小鼠腹腔滲出液中蛋白、PGE2含量也顯著降低，與未處理組相比，呈顯著性差異。此結(jié)果說(shuō)明：

9、礬制可以顯著降低半夏、掌葉半夏毒針晶的致炎及凝集素蛋白的促炎效應(yīng)。
　　 3.礬制對(duì)半夏及掌葉半夏毒針晶結(jié)構(gòu)、毒針晶蛋白組成及掌葉半夏凝集素的影響
　　 采用電鏡掃描技術(shù)研究半夏、掌葉半夏毒針晶在礬制過(guò)程中晶型的變化；以27Al-NMR分析研究白礬溶液炮制針晶后的上清液中存在的鋁離子的形態(tài)，考察白礬溶蝕針晶結(jié)構(gòu)是否與三價(jià)鋁離子絡(luò)合毒針晶中草酸根離子相關(guān)；采用SDS-PAGE電泳方法研究礬制對(duì)半夏、掌葉半夏凝集素及毒針晶蛋

10、白的影響；對(duì)礬制毒針晶上清液中的蛋白電泳條帶進(jìn)行膠內(nèi)酶解后質(zhì)譜分析、蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)搜索，分析礬制過(guò)程中蛋白肽序列的變化。結(jié)果顯示，電鏡掃描圖可見半夏、掌葉半夏毒針晶在礬制過(guò)程中針晶的晶型和結(jié)構(gòu)被破壞；27Al-NMR分析，與空白對(duì)照，半夏、掌葉半夏毒針晶經(jīng)礬制后上清液均在化學(xué)位移δ=6.00ppm左右處出現(xiàn)新的峰，以對(duì)照品對(duì)照，顯示Al3+與毒針晶中的C2O42-形成的是單配體絡(luò)合物。
　　 半夏、掌葉半夏凝集素蛋白礬制前后電泳

11、條帶未見明顯變化；毒針晶經(jīng)白礬浸泡后的上清液中檢測(cè)到凝集素蛋白,且其分子量未見明顯變化，肽序列質(zhì)譜分析及比對(duì)結(jié)果顯示，未處理的半夏及掌葉半夏毒針晶蛋白條帶中均檢測(cè)到11條凝集素蛋白序列，與NCBI蛋白質(zhì)庫(kù)中凝集素前體蛋白序列的比對(duì)，顯示分別比對(duì)到11條和9條，比對(duì)率較高；半夏、掌葉半夏毒針晶礬制上清液中的蛋白條帶中分別檢測(cè)到24和17條肽段序列，其中分別有6條和4條與相對(duì)應(yīng)的未處理毒針晶組相同，表明白礬浸泡針晶后上清液確實(shí)存在凝集素蛋白

12、，說(shuō)明白礬溶液可以使得毒針晶上的凝集素蛋白溶解于上清液中，但與NCBI蛋白質(zhì)庫(kù)中凝集素前體蛋白序列的比對(duì)，顯示上清液中半夏凝集素比對(duì)到8條序列，掌葉半夏凝集素只比對(duì)到3條序列，比對(duì)率相較于未處理組明顯下降，表明半夏、掌葉半夏毒針晶中的凝集素蛋白被溶解的同時(shí)，白礬溶液還使得凝集素蛋白發(fā)生降解。礬制后毒針晶上蛋白含量下降。白礬溶液中Al3+絡(luò)合草酸根，使毒針晶溶解，白礬使毒針晶上毒蛋白溶解降解，兩種作用均可導(dǎo)致半夏及掌葉半夏毒針晶及塊莖的毒

13、性顯著下降。
　　 通過(guò)上述研究表明，半夏、掌葉半夏共性的毒性成分毒針晶及凝集素蛋白，其誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用相似。凝集素蛋白具有顯著的致炎作用并存在量-毒、時(shí)-毒關(guān)系，并且可以協(xié)同毒針晶產(chǎn)生更加嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步證明了半夏及掌葉半夏的毒性是毒針晶產(chǎn)生的機(jī)械刺激與化學(xué)刺激性雙重作用的結(jié)果。半夏、掌葉半夏復(fù)制法礬制減毒機(jī)制為，白礬溶液中的Al3+可絡(luò)合毒針晶草酸鈣中的草酸形成單配體絡(luò)合物，使草酸鈣溶解，針晶的剛性結(jié)構(gòu)破壞；同時(shí)白礬