兔間充質干細胞分離培養(yǎng)和體外向軟骨細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的： 1.建立一種分離培養(yǎng)兔骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)的有效方法，并觀察BMSCs在特定培養(yǎng)條件下向軟骨細胞分化的情況。 2.探討使用G-CSF動員兔外周血，分離培養(yǎng)外周血間充質干細胞(peripheral　blood mesenchymal stem cells，PBMSCs)的方法。 方法： 1.以4月齡新西蘭

2、大耳白兔為實驗對象，采用密度梯度離心法、全血培養(yǎng)法、氯化胺紅細胞溶解法，分離培養(yǎng)BMSCs，對其細胞存活率、細胞克隆率、首次傳代時間、15d后細胞數(shù)及擴增成功率進行比較。 2.用含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)-2的條件培養(yǎng)液誘導BMSCs在體外單層培養(yǎng)模式下向軟骨細胞分化。采用甲苯胺藍染色、Masson染色、免疫組織化學染色、阿利新藍比色法測定糖胺聚糖(glycosamino

3、glycan,GAG)的含量來檢測BMSCs分化情況。統(tǒng)計學分析比較第2、4、7代(P2、P4、P7)BMSCs誘導后增殖能力及向軟骨細胞分化能力的變化。 3.給新西蘭兔皮下注射粒細胞集落刺激因子30μg/(kg·d)4d，抽取動員前后兔外周血采用密度梯度離心法進行分離培養(yǎng)。 結果： 1.對于細胞存活率而言，密度梯度離心法和全血培養(yǎng)法均優(yōu)于氯化胺紅細胞溶解法。在其它指標比較中，密度梯度離心法>全血培養(yǎng)法>氯化胺紅

4、細胞溶解法。 2.BMSCs定向誘導后表現(xiàn)出軟骨細胞的特性，P2、P4間的細胞增殖能力和成軟骨細胞分化能力比較差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)：P7與P2、P4相比，細胞增殖能力和成軟骨細胞分化能力均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 3.未動員的外周血中未發(fā)現(xiàn)有梭形細胞貼壁：動員后的外周血中發(fā)現(xiàn)有梭形細胞貼壁，而且這細胞可以形成小的集落，但是增殖緩慢，增殖能力有限，不能人量擴增。 結論： 1.利用