骨碎補對人牙齦成纖維細胞體外誘導作用的實驗研究.pdf

1、目的： 牙周病是危害人類健康的兩大口腔疾病之一，主要由感染、創(chuàng)傷、遺傳等多種致病因素引起，這些致病因素破壞牙齒的支持結構，最終導致牙齒松動、脫落，因此牙周病是成人失牙的主要原因。牙周病治療是以修復牙周組織缺損、恢復牙周組織正常結構和功能為最終目標，目前常規(guī)的治療方法卻難以達到理想的組織再生效果。牙周組織再生的基礎是牙槽骨和牙骨質的再生，存在的難題是病損局部能夠參與骨組織再生的細胞來源有限，數量不足。繼引導組織再生術后，組織工程技

2、術的出現為實現牙周組織完全再生提供了新的思路，成為研究熱點之一。組織工程學的基本方法是將體外培養(yǎng)的正常組織細胞擴增后吸附于生物相容性良好，并可被人體逐步降解吸收的生物材料上，形成細胞一生物材料復合物，將這一復合物植入機體組織、器官缺損部位，種植的細胞在生物支架材料逐步降解吸收的過程中，繼續(xù)增殖并形成新的具有原有特殊形態(tài)和功能的組織器官，達到修復組織器官的缺損和重建其功能的目的。組織工程技術的關鍵是獲得大量功能相關的種子細胞。已有學者嘗試

3、引入骨組織工程技術治療牙周組織缺損，并在動物實驗中取得了初步的成效<'[1]>。但既往常采集骨、骨膜、骨髓來源的種子細胞大都存在取材不易，對機體損傷較大的缺點。有實驗證明<'[2]>，某些來源于骨外組織的細胞，如成纖維細胞等，在誘導因子的持續(xù)作用下，可以向成骨細胞轉化并保持其成骨能力。但成纖維細胞的成骨能力是有條件的，即必須在特定條件影響下才能表現出其成骨特征。摸索促使成纖維細胞向成骨細胞轉化并保持其成骨能力的適宜條件，須體外進行活細胞

4、實驗。在牙周組織中最主要的兩種成纖維細胞是牙齦及牙周膜成纖維細胞。有研究表明，人牙周膜細胞具備多向分化潛能，因其在適宜誘導條件下能表達成骨細胞表型并能在體外培養(yǎng)中形成礦化組織<'[3]>而成為牙周組織再生中較為理想的種子細胞，但其來源有限，取材不易，且較難繁育。而牙齦成纖維細胞作為牙周組織的組成成分，來源豐富、容易獲得、具有很強的生長和自我繁殖能力，雖較牙周膜細胞表達成骨表型及礦化的能力較弱，但可以設想，只要能對牙齦成纖維細胞施以有效的

5、誘導因素，使其表達成骨細胞表型，則有望用牙齦成纖維細胞替代牙周膜細胞，成為牙周組織修復再生中理想的種子細胞。 骨碎補為傳統(tǒng)的中國骨傷科常用中藥，具有補腎、活血、止痛、續(xù)骨療傷之功效，其可促進體外成骨細胞增殖、分化、鈣化。本實驗擬利用骨碎補獨特的藥理作用，將其作為一種誘導因子作用于體外培養(yǎng)的人牙齦成纖維細胞，通過觀察對比所培養(yǎng)細胞的超微結構、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性及細胞周期的改變，探索骨

6、碎補對人牙齦成纖維細胞成骨表型的體外誘導作用等生物學特性的影響，骨碎補的藥物濃度效應及最佳作用濃度等問題，為將來骨碎補誘導牙齦成纖維細胞表達成骨表型、代替牙周膜細胞應用于組織工程促進牙周組織再生提供一定的理論依據，為其作為一種新型的誘導因子應用于人牙周組織工程領域提供新思路。 方法： 采用組織塊法分離培養(yǎng)人牙齦成纖維細胞，制備骨碎補提取液作用于細胞，通過觀察細胞超微結構、ALP活性、細胞周期的改變，探討骨碎補對細胞的體

7、外誘導作用。 1 人牙齦成纖維細胞的原代培養(yǎng)、傳代及來源鑒定選取需進行正畸減數拔牙的青少年健康牙齦，采用組織塊法進行牙齦成纖維細胞的原代培養(yǎng)。當細胞生長至鋪滿瓶底80％時進行傳代。經傳代后獲得大量可供實驗用的種子細胞。 取第2代細胞進行角蛋白染色及波形絲蛋白染色，做來源鑒定。 2 骨碎補提取液的制備將骨碎補加適量水煎煮，過濾，濃縮，醇沉，活性炭脫色，過濾除菌。所得提取液用含2％胎牛血清(Fetal boyine

8、serum，FBS)的DMEM(dulbecco's modifled eagle medium)培養(yǎng)液稀釋成5個不同的終濃度。調整PH至7.0～7.1，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?3 實驗分組 實驗組細胞加入骨碎補提取液，對照組加入含2％FBS的DMEM培養(yǎng)液。 4 ALP活性測定取第4代人牙齦成纖維細胞，接種于24孔培養(yǎng)板中，隨機分為5個濃度實驗組和1個對照組，每組4孔。培養(yǎng)7d，棄孔內液體，加入Triton X

9、-100，4℃過夜后，取上述各孔液體及空白對照的雙蒸水一并轉入另一96孔板。按ALP試劑盒說明依次按比例加入緩沖液、基質液，水浴，加入顯色劑后在酶聯儀上于410 nm波長下測0D值，取每組4孔的平均值，間接反映細胞的ALP活性，以活性最高組骨碎補的濃度為最佳濃度用于以下實驗。 5 形態(tài)學觀察 5．1在倒置相差顯微鏡下觀察細胞游出及生長狀況，并行吉姆薩染色，光學顯微鏡下觀察。 5．2掃描電鏡觀察取第5代生長狀態(tài)良

10、好的人牙齦成纖維細胞，接種于預先放有蓋玻片的6孔板中。隨機分為實驗組和對照組，實驗組用最佳濃度骨碎補提取液的培養(yǎng)基。培養(yǎng)7 d，取出蓋玻片，洗滌固定，常規(guī)制備樣品，掃描電鏡觀察。 5．3透射電鏡觀察取第5代生長狀態(tài)良好的人牙齦成纖維細胞，接種在50 ml培養(yǎng)瓶中，隨機分為實驗組和對照組，實驗組用最佳濃度骨碎補提取液的培養(yǎng)基。培養(yǎng)7 d，細胞刮刮取細胞，洗滌固定，常規(guī)制備樣品，透射電鏡觀察。 6 測定細胞周期取第6代生

11、長狀態(tài)良好的人牙齦成纖維細胞，接種于50ml培養(yǎng)瓶中，隨機分為實驗組和對照組，每組3瓶。實驗組用最佳濃度骨碎補提取液的培養(yǎng)基。培養(yǎng)7 d，將細胞消化、離心，70％冰乙醇固定后流式細胞儀測定細胞周期。 7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，檢測結果以均數±標準差(X±S)表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。應用單因素方差分析方法對ALP檢測結果進行統(tǒng)計學分析，應用兩樣本均數的t檢驗對細胞周期結果進行統(tǒng)計學分析

12、。 結果 1 采用組織塊原代培養(yǎng)法成功培養(yǎng)出人牙齦成纖維細胞。倒置相差顯微鏡下觀察，接種3～7 d有細胞從組織塊周圍游出，放射狀排列。14 d時細胞生長約鋪滿培養(yǎng)瓶底的80％，以1：1進行首次傳代。傳代后細胞生長迅速，約7～10 d傳代一次。 2 傳代時經消化后的細胞回縮呈小球形，折光性好，4 h左右開始伸展，24 h后細胞大部分貼壁，伸展成均一的梭形。當培養(yǎng)時間延長至14 d，細胞生長密集時可出現復層生長。

13、 3 ALP檢測結果顯示，實驗組ALP的0D值均高于對照組(P<0.05)，且實驗組骨碎補濃度為100μg/ml時其ALP活性最佳。 4 吉姆薩染色可見細胞胞核呈藍紫色，胞漿染成粉紅色，均勻，胞體豐滿伸展良好，核圓，核仁清晰。 掃描電鏡觀察，實驗組與對照組相比，細胞表面有豐富的枝狀嵴，交織成網狀，嵴上附大量微小囊泡。細胞周圍可見細胞外基質。 透射電鏡觀察，實驗組與對照組相比，細胞器增多，胞質內有豐富的

14、粗面內質網、線粒體和游離核糖體等。細胞核內常染色質均勻分布，異染色質較少。 5 細胞周期檢測，經骨碎補作用后，與對照組相比，實驗組G<,1>期細胞減少，S期和G<,2>M期細胞增多，同時實驗組增殖指數PrI值高于對照組(P<0.05)。 結論 1 采用組織塊法可成功培育出人牙齦成纖維細胞，原代及傳代細胞呈均一的成纖維細胞樣，生長旺盛，分裂較快，可出現復層生長，能夠滿足實驗中所需大量的種子細胞。 2 中藥骨