豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及豬MEF2B和MEF2C基因的初步研究.pdf

1、骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是骨骼肌中位于肌細(xì)胞膜和基膜之間的具有增殖分化潛力的肌源性細(xì)胞。它們在一般情況下是處于靜息狀態(tài)的，當(dāng)被激活后，具有增殖分化、融合成肌管、再形成肌細(xì)胞的能力。由于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在骨骼肌生長發(fā)育以及再生中扮演著非常重要的地位，很多科學(xué)家已經(jīng)開始研究它的生理特性，目前國內(nèi)外豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的研究工作開展的還比較少；而肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（MEF2）屬于MADS框轉(zhuǎn)錄因子家族，它們在肌肉發(fā)生過程中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，目前關(guān)于豬ME

2、F2因子的研究還未見報(bào)道。 本研究中，建立并完善了豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)方法。采用I型膠原酶和胰蛋白酶兩步消化法獲取新生豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，并進(jìn)行體外原代和傳代培養(yǎng)。觀察細(xì)胞各個(gè)階段的形態(tài)，通過生長曲線等手段研究骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化能力，利用RT-PCR以及免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)所獲得的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示兩步消化法適用于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的獲取。在生長培養(yǎng)基作用下，細(xì)胞增殖旺盛；在分化培養(yǎng)基下，細(xì)胞分化良好，可融合成肌管。

3、 通過比較基因組學(xué)的方法克隆了豬MEF2基因家族中的MEF2B和MEF2C基因以及豬CACNGI基因。獲得了包括完整編碼區(qū)的長度為1940bp的MEF2C基因和長度為1136bp的CACNGI基因的cDNA序列；通過RACE得到了豬MEF2B基因的5′非翻譯區(qū)序列，將該序列與PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物拼接后得到了長度大約為1070bp的豬MEF2B基因cDNA序列。將豬MEF2C、MEF2B和CACNG1基因的序列提交到NCBI中GenBank

4、中，登錄號(hào)分別為DQ343149、DQ366898和DQ323981。 分析豬MEF2C和MEF2B基因的編碼區(qū)序列發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)基因都含有MADS保守結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步將豬的MADS保守結(jié)構(gòu)域和人及小鼠的結(jié)構(gòu)域比對(duì)發(fā)現(xiàn)此順式作用元件非常保守，表明MEF2因子在這3個(gè)物種肌肉發(fā)生過程中扮演同樣重要的作用。比較豬MEF2C基因和人MEF2C基因的編碼區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)它們間的相似性為91％，同時(shí)發(fā)現(xiàn)豬MEF2C基因序列缺少了與人第8外顯子以及第

5、11外顯子的部分序列相對(duì)應(yīng)的序列，由于在人、鼠研究上證明MEF2家族存在多種剪接體，因此預(yù)測豬MEF2C基因也存在不同的剪接體。 RT-PCR分析了豬MEF2B和MEF2C基因在組織以及骨骼肌細(xì)胞體外分化過程中的表達(dá)情況。組織表達(dá)譜分析結(jié)果表明，兩個(gè)基因除了在胃、小腸、胚胎等組織無法檢測到外，其他組織都有大量的表達(dá)；而在骨骼肌細(xì)胞體外分化過程中的表達(dá)模式研究發(fā)現(xiàn)，隨著分化的深入，兩個(gè)基因的表達(dá)量越來越大；而在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞時(shí)期兩

6、個(gè)基因的表達(dá)量很少，這與組織表達(dá)譜分析中胚胎幾乎無法檢測到兩個(gè)基因表達(dá)的結(jié)果是一致的。 獲得了大白、梅山、長白等三個(gè)品種的豬MEF2B基因的第2、8內(nèi)含子以及豬MEF2C基因的第7、8內(nèi)含子序列。通過序列比較，發(fā)現(xiàn)在豬MEF2B基因的第2內(nèi)含了147bp處出現(xiàn)堿基T－C轉(zhuǎn)換（梅山豬中為T，大白豬中為C），可引起限制性內(nèi)酶Eco721酶切多態(tài)性，在大白×梅山F2代資源家系中進(jìn)行PCR-RFLP基因分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存大白×梅山F2代資

7、源家系中存在著嚴(yán)重的偏態(tài)：而在豬MEF2B基因的第8內(nèi)含子中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的微衛(wèi)星重復(fù)序列（AG重復(fù)序列），重復(fù)測序結(jié)果表明在梅山中為（AG）<,12>，大白為（AG）<,27>，長白為（AG）<,29>，在大白×梅山F2代資源家系中進(jìn)行PCR－SSR分析，結(jié)果表明該微衛(wèi)星位點(diǎn)與皮厚、背膘厚、胴體長、眼肌高以及眼肌寬等性狀顯著相關(guān)。 目前在國內(nèi)鮮有以豬的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞為模型研究基因功能的報(bào)道，本研究首先探討了豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培