硫唑嘌呤治療炎癥性腸病療效及安全性監(jiān)測(cè)體系的建立.pdf

1、炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)包括克羅恩病(Crohn’s disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)，是以腸道免疫功能紊亂為主的非特異性炎性疾病。 在炎癥性腸病的藥物治療中，免疫抑制劑如硫唑嘌呤(Azathioprine，AZA)，6-巰嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)等有著不可替代的作用。循證醫(yī)學(xué)證明免疫抑制劑能有效誘導(dǎo)和維

2、持IBD的緩解，并減少激素依賴[3-5]。但是AZA和6-MP的治療存在很大的個(gè)體差異。在活動(dòng)期患者的治療中，約2／3的患者能誘導(dǎo)緩解，15％患者完全無(wú)效，而約有9-28％的患者在治療過(guò)程中發(fā)生了嚴(yán)重的副反應(yīng)，如骨髓抑制和肝臟毒性[6，7]。藥物個(gè)體療效的不確定性和對(duì)于藥物嚴(yán)重毒副作用的顧慮都限制了AZA及6-MP在IBD患者中的使用，因而降低了IBD患者的治療質(zhì)量，在國(guó)內(nèi)這一矛盾尤其突出。 AZA類藥物治療的個(gè)體差異與其代謝途

3、徑密不可分。AZA及6-MP本身均無(wú)活性，必須經(jīng)過(guò)體內(nèi)一系列酶代謝途徑，最終生成活性產(chǎn)物6-硫基鳥嘌呤核苷酸(6-thioguanine nuclcotides，6-TGNs)而產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)而發(fā)揮療效，但亦是骨髓抑制的主要原因。而硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(thiopurine S-methyltmnsferase，TPMT)是AZA及6-MP藥物代謝途徑中重要的代謝酶，競(jìng)爭(zhēng)性抑制6-TGNs的生成，并與AZA類藥物毒副作用及療效有著重要關(guān)系。

4、1980年Weinshiboum首先報(bào)道高加索人種中TPMT的活性具有多態(tài)性[8]。高加索人種中TPMT活性呈三態(tài)分布，大約0.3％的高加索人為TPMT酶活性減低或缺乏，11.1％酶活性中等，88.6％呈正?；蚋呋钚浴．?dāng)接受推薦劑量的AZA類藥物治療時(shí)，若TPMT活性降低或缺乏，會(huì)生成過(guò)多的6-TGNs，骨髓抑制的風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)大大增加[9，10]；若TPMT活性過(guò)高，一方面不能生成足夠的6-TGNs，達(dá)到有效的治療效果[11-13]，另一方

5、面，會(huì)生成過(guò)多的6-甲基巰嘌呤核糖核酸(6-methylmercaptopurine nucleotides，6-MMPR)，可能導(dǎo)致肝臟毒性的發(fā)生[14,15]。 TPMT基因多態(tài)性是TPMT活性差異的遺傳基礎(chǔ)。TPMT基因突變導(dǎo)致TPMT活性下降[8]。研究顯示，TPMT表型與基因型檢測(cè)結(jié)果的一致率達(dá)到了98.4％[16]。TPMT野生純合子對(duì)應(yīng)于TPMT高活性，突變雜合子對(duì)應(yīng)于TPMT中等活性，突變純合子對(duì)應(yīng)于TPMT活性缺乏[1

6、1,17]。目前已發(fā)現(xiàn)20余種TPMT突變等位基因(*2，*3A,*3B，*3C，*3D，*4-*19)可能與酶活性降低和／或AZA類藥物毒副作用有關(guān)[18]。其中在高加索人種中TPMT*2(G238C)，*3A(G460A及A719G)，*3B(G460A)，"3C(A719G)四種突變最為常見(jiàn)，占了約95％[19]。 因此為了了解中國(guó)IBD患者的治療現(xiàn)狀，研究中國(guó)漢族IBD患者TPMT基因多態(tài)性分布狀況及其與健康人群分布差異

7、，以及TPMT遺傳多態(tài)性與藥物毒副作用及療效的關(guān)系，從而提高用藥安全性，建立個(gè)體化治療方案，我們?cè)O(shè)計(jì)了以下四個(gè)步驟的研究。 首先，為了了解IBD的治療現(xiàn)狀，我們進(jìn)行了以醫(yī)院為基礎(chǔ)的IBD患者治療現(xiàn)狀的回顧性研究。對(duì)收治浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院的177例IBD患者(71例CD，106例UC)的臨床特征及藥物治療包括5一氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、灌腸、免疫抑制劑的治療情況進(jìn)行了分析，并建立了IBD患者數(shù)據(jù)庫(kù)軟件系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)部

8、分IBD患者沒(méi)有得到指南所推薦的治療。27.8％的重度患者未得到靜脈或口服糖皮質(zhì)激素的治療。遠(yuǎn)端或左半結(jié)腸炎患者只有54.4％的患者給予了灌腸治療，美沙拉嗪灌腸治療使用率更低。特別是免疫抑制劑的使用率低下，在有使用免疫抑制劑治療適應(yīng)癥的患者中，只有19.6％接受了免疫抑制劑的治療，且藥物劑量不足。中國(guó)IBD患者免疫抑制劑的低使用率源于臨床缺乏該類藥物安全性的檢測(cè)手段，如TPMT基因多態(tài)性的檢測(cè)。那么作為有潛在使用AZA治療可能的人群，中

9、國(guó)IBD患者TPMT基因多態(tài)性的分布如何，是否與健康人相近呢? 第二步，我們運(yùn)用引物特異性多聚酶鏈反應(yīng)(allele-specific polymerase reaction chain)及多聚酶鏈反應(yīng)一限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(polymerase reaction chain-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法，對(duì)來(lái)自中國(guó)浙江地區(qū)的189例IBD患者及27

10、3例健康漢族人進(jìn)行了TPMT基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國(guó)漢族IBD患者和健康人群存在的最主要的TPMT突變等位基因?yàn)門PMT*3C，未發(fā)現(xiàn)TPMT*2，TPMT*3A，TPMT*3B突變存在。健康漢族人群。TPMT*3C突變等位基因頻率為1.47％，總的突變等位基因頻率低于高加索人種。IBD患者TPMT*3C突變等位基因頻率1.59％，與健康對(duì)照組相近(

11、p=1.000)。UC組TPMT*3C突變等位基因頻率為2.45％，高于CD組(0.57％)，但兩組之間分布比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.147)。了解了中國(guó)漢族IBD患者TPMT基因多態(tài)性分布情況后，我們發(fā)現(xiàn)該人群突變等位基因頻率低于高加索人種。這一結(jié)果是否預(yù)示著中國(guó)漢族IBD患者使用AZA治療更安全，藥物毒副作用發(fā)生率低呢?在臨床中AZA類藥物的安全性到底如何，TPMT基因多態(tài)性與AZA藥物毒副作用的相關(guān)性如何，是否可以通過(guò)基因多態(tài)性檢

12、測(cè)來(lái)預(yù)測(cè)AZA的藥物毒副作用呢?為解決這一問(wèn)題，我們進(jìn)行了TPMT*2，*3A，*3B，*3C突變等位基因與AZA藥物毒副作用的相關(guān)性研究。 第三步，我們對(duì)43例接受AZA維持治療的IBD患者監(jiān)測(cè)骨髓抑制及肝臟毒性的發(fā)生情況，并運(yùn)用引物特異性PCR及PCR-RFLP方法檢測(cè)TPMT*2,TPMT*3A，TPMT*3B，TPMT*3C四種TPMT突變等位基因，進(jìn)一步對(duì)5例發(fā)生藥物毒副作用的患者進(jìn)行。TPMT外顯子測(cè)序，并分析AZA

13、藥物毒副作用與TPMT基因多態(tài)性之間的相關(guān)性。結(jié)果在對(duì)43例接受AZA治療的IBD患者的隨訪中，觀察到有4例患者發(fā)生了骨髓抑制，1例發(fā)生了肝臟毒性。而基因多態(tài)性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該5例患者均不存在TPMT*2，*3A，*3B，*3C這4種常見(jiàn)的TPMT突變等位基因。進(jìn)一步對(duì)該5例患者進(jìn)行外顯子測(cè)序工作，發(fā)現(xiàn)其中3例患者存在TPMT*1S突變雜合子，即7號(hào)外顯子17772479 T→C突變，導(dǎo)致cDNA 474位T→C改變，但是編碼的第158個(gè)氨基

14、酸仍為異亮氨酸，沒(méi)有發(fā)生改變，為無(wú)義突變。在第三部分對(duì)AZA治療的IBD患者的基因多態(tài)性與藥物毒副作用關(guān)系的研究中，我們發(fā)現(xiàn)AZA藥物毒副作用無(wú)法完全通過(guò)TPMT基因突變來(lái)解釋。而TPMT活性除基因多態(tài)性外，還受到其他多種因素例如未知突變、藥物間相互作用的影響。那么在中國(guó)漢族IBD患者中是否可以直接通過(guò)TPMT活性檢測(cè)來(lái)預(yù)測(cè)AZA的藥物毒副作用，TPMT活性與AZA藥物療效的關(guān)系又如何呢? 第四步，我們采用反相高效液相色譜法(H

15、igh performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)TPMT活性，初步探討中國(guó)漢族IBD患者，IPMT活性與AZA藥物毒副作用及療效的關(guān)系。以13例服用AZA治療的IBD患者為研究對(duì)象，運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定紅細(xì)胞內(nèi)TPMT的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)生早期骨髓抑制的3例患者TPMT平均活性低于沒(méi)有發(fā)生骨髓抑制的患者(9.3±2.1 U／mlpRBC vs 18.0±6.2 U/ml pRBC;p=0

16、.046)，并且低于早期未發(fā)生骨髓抑制的患者組(9.3±2.1 U／ml pRBC vs 17.7±5.5 U／ml pRBC;p=0.029)。發(fā)生肝臟毒性的患者1例，TPMT活性為28.8 U／ml pRBC，明顯高于沒(méi)有發(fā)生肝臟毒性的患者(14.7+4.8U／ml pRBC)。其中有3例發(fā)生骨髓抑制的患者在AZA減量至50mg/d后能夠耐受維持治療。AZA治療中維持緩解的IBD患者TPMT活性顯著低于沒(méi)有誘導(dǎo)緩解的患者(13.7±

17、3.5 U／ml pRBC Vs 22.0±5.5 U／ml pRBC; p=0.009)。 以醫(yī)院為基礎(chǔ)的IBD患者治療現(xiàn)狀研究顯示，部分IBD患者未得到理想治療。尤其是對(duì)AZA類藥物毒副作用的顧慮限制了免疫抑制劑的使用，降低了IBD的治療質(zhì)量，主要原因是臨床缺乏相應(yīng)的預(yù)測(cè)方法。在第二、三、四部分的研究中，我們建立了可靠的TPMT基因多態(tài)性及酶活性的檢測(cè)方法。發(fā)現(xiàn)漢族IBD患者TPMT突變等位基因頻率較低，且對(duì)發(fā)生藥物毒副作用