TaClo對體外培養(yǎng)大鼠中腦腹側(cè)多巴胺能神經(jīng)元的毒性作用的研究.pdf

1、研究背景：Bringmann等于1995年發(fā)現(xiàn)1-三氯甲基-1,2,3,4-四氫化-β-咔啉(TaClo)。TaClo是三氯乙烯在體內(nèi)代謝的產(chǎn)物。20世紀(jì)初,三氯乙烯曾作為驅(qū)蟲劑、麻醉劑和人工流產(chǎn)劑而應(yīng)用很長時間,在工業(yè)上則作為溶劑、清洗劑等廣泛應(yīng)用到現(xiàn)在。近年來發(fā)現(xiàn),長時間地接觸較低濃度的TCE可對暴露者的神經(jīng)行為功能產(chǎn)生很大的影響,主要表現(xiàn)在注意力和短時記憶力降低,手運動遲緩,手一眼運動穩(wěn)定性和協(xié)調(diào)性差等神經(jīng)退行性改變。TaClo在

2、體內(nèi)主要分布于腎臟、肝臟和腦。由于TaClo的分子結(jié)構(gòu)與對1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)的相似,而且易于蓄積在腦中,其在中樞神經(jīng)功能退行性疾病中的作用逐漸引起了廣泛的關(guān)注。美國肯塔基大學(xué)Don Gash等在一項帕金森病的臨床試驗中發(fā)現(xiàn),長時間接觸TCE可增加患帕金森綜合癥的風(fēng)險。
　　 目的：完善高效的多巴胺能神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法;研究TaClo對體外培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元凋亡中的作用及其機(jī)制。
　　

3、 方法：取孕14天SD大鼠,乙醚麻醉后,常規(guī)腹部消毒開腹,取出子宮,取出胚胎,置顯微鏡下剝離外膜,切取中腦腹側(cè)部分,0.1％胰蛋白酶37℃水浴消化。胎牛血清終止消化。玻璃移液管反復(fù)輕柔吹打,再用10μl移液槍頭吹打數(shù)次。離心后棄上清液,加入含血清DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為每30μl細(xì)胞懸液1×105個細(xì)胞,每孔30μl微島法接種于預(yù)先多聚賴氨酸包被的24孔培養(yǎng)板中。靜置于5％CO2培養(yǎng)箱中,37℃培

4、養(yǎng)1小時。待細(xì)胞貼壁后,加入500μl完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)7天至細(xì)胞成熟,即為神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)。原代神經(jīng)元培養(yǎng)方法同上,接種24小時后加阿糖胞苷作用48小時。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),多巴胺能神經(jīng)元TH染色計數(shù)。分別用不同濃度的TaClo(50、100、200、500、1000μol/L)對原代神經(jīng)元一膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)和原代神經(jīng)元培養(yǎng)的中腦腹側(cè)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),作用72小時后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞TH免

5、疫細(xì)胞化學(xué)染色后多巴胺能神經(jīng)元計數(shù);分別用終濃度為50和200μmol/L的TaClo干預(yù)原代神經(jīng)元一膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)的細(xì)胞,作用1小時、24小時后,Western-blot法測Caspase-3蛋白表達(dá)。利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS13.0對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果：培養(yǎng)7天后在倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞核大,胞核清亮,卵圓形或圓形,核膜清晰,核仁可見,胞質(zhì)透亮,胞體多形性,有較多突起,突起之間相互聯(lián)系。TH免疫細(xì)胞化學(xué)染色

6、后,呈棕褐色,胞體軸突清晰較長的為多巴胺能神經(jīng)元。TaClo作用后多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量明顯下降,50μmol/L濃度的TaClo誘發(fā)40％的多巴胺能神經(jīng)元死亡;當(dāng)TaClo濃度為200μmol/L時,接近90％的多巴胺能神經(jīng)元死亡(P＜0.01 and P＜0.001);TaClo(50μmol/L、100μmol/L、200μ mol/L)誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元死亡具有明顯的劑量依賴性,結(jié)果有顯著性差異(P＜0.001)。Western-