ETV1在胃腸道間質(zhì)瘤中的表達(dá)及致瘤調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST)是消化系統(tǒng)最常見的間葉源性腫瘤，占胃腸道腫瘤的1％-4％。在人群中，GIST的發(fā)病率約為1/10萬(wàn)-2/10萬(wàn)人，近年來(lái)呈明顯增加趨勢(shì)。目前多認(rèn)為GIST起源于胃腸道起搏細(xì)胞Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICC)或其前體細(xì)胞。大部分GIST的發(fā)生與C-Kit(85％)和PDGFRA(10

2、％)基因發(fā)生功能獲得性突變有關(guān)。手術(shù)切除是GIST首選的治療方式，但術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高達(dá)55％～90％，不能切除者中位生存期小于12個(gè)月，傳統(tǒng)的放化療對(duì)GIST基本無(wú)效。小分子酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼(imatinib)靶向作用于KIT和PDGFRA治療轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性GIST已取得明顯療效，但是只有小于3％的患者能夠獲得完全緩解。大約50％的患者在伊馬替尼初始治療2年內(nèi)發(fā)生繼發(fā)性耐藥，耐藥患者中位生存期僅為15個(gè)月。另一方面，野生型和

3、PDGFRAD842V突變的GIST對(duì)伊馬替尼治療不敏感。因此，單靠KIT抑制劑不能治愈GIST。深入探索GIST耐藥機(jī)制，尋找新的靶向治療方案迫在眉睫。
　　ETS家族是最大的信號(hào)依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族之一，其過度表達(dá)和許多人類腫瘤發(fā)生有關(guān)，近年來(lái)已成為各國(guó)學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)30多個(gè)ETS家族成員，它們均含有一個(gè)由85個(gè)氨基酸組成的特異DNA結(jié)合區(qū)（ETS區(qū)），該區(qū)與靶基因啟動(dòng)區(qū)一個(gè)富含嘌呤的序列GGAA/T結(jié)合后調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)

4、錄。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生、分化、凋亡及上皮-間質(zhì)相互作用，ETS家族蛋白參與許多生理和病理過程。ETS變異體1(ETV1，ER81)是ETS家族成員之一，在染色體上定位為7p21.3。已有研究表明，ETV1在乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、尤文氏瘤中過度表達(dá)，參與腫瘤的形成和發(fā)展。Chi P等研究發(fā)現(xiàn)ETV1是GIST起源細(xì)胞存活的特異因子，在GIST細(xì)胞中存在異常表達(dá)，且ETV1在GIST中的表達(dá)水平明顯高于其他腫瘤，包括胃癌、肝癌、結(jié)直腸

5、癌、前列腺癌、黑色素瘤、卵巢癌等。并且ETV1能夠與KIT協(xié)同作用，調(diào)控GIST細(xì)胞的增殖凋亡與惡性轉(zhuǎn)變。若能進(jìn)一步證實(shí)ETV1調(diào)控GIST的致瘤轉(zhuǎn)化，那么靶向ETV1或ETV1相關(guān)信號(hào)治療將能夠解決GIST的imatinib耐藥問題，成為GIST分子靶向治療的一大突破。
　　目的：
　　檢測(cè)ETV1在胃腸道間質(zhì)瘤組織和胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系(GIST882)中的表達(dá)，分析GIST及對(duì)應(yīng)瘤旁正常組織ETV1的表達(dá)差異，探究其與K

6、IT表達(dá)、臨床病理特征及危險(xiǎn)程度分級(jí)的相互關(guān)系。通過體外合成siRNA干擾ETV1表達(dá)，觀察ETV1對(duì)GIST882細(xì)胞增殖能力的影響及其與細(xì)胞周期、凋亡的關(guān)系。探討ETV1影響胃腸道間質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的可能分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和Western Blot法檢測(cè)72對(duì)新鮮胃腸道間質(zhì)瘤及其瘤旁正常組織、胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系(GIST882)中ETV1基因和蛋白水平的表達(dá)。運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)

7、胃腸道間質(zhì)瘤組織芯片（156例標(biāo)本）ETV1的分布和表達(dá)強(qiáng)度。分析ETV1的表達(dá)與胃腸道間質(zhì)瘤臨床病理特征的相互關(guān)系。
　　2、利用化學(xué)合成的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染胃腸道間質(zhì)瘤(GIST882)細(xì)胞，下調(diào)ETV1的表達(dá)，采用qRT-PCR法、Western blot法檢測(cè)ETV1表達(dá)變化。根據(jù)基因沉默效率進(jìn)行篩選、并確定其中一條siRNA作為后續(xù)研究使用。通過細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒CCK-8檢測(cè)ETV1下調(diào)對(duì)GIST882細(xì)胞增殖

8、能力的影響，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)ETV1下調(diào)對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。
　　3、通過Western Blot法檢測(cè)上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Ras/Raf/MEK/ERK等相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　本實(shí)驗(yàn)共收集72例胃腸道間質(zhì)瘤手術(shù)切除新鮮標(biāo)本。Western Blot和熒光定量PCR的結(jié)果顯示ETV1及KIT在GIST腫瘤組織中高度表達(dá)，而在正常瘤旁組織和其他類型的肉瘤組織中均無(wú)表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

9、胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系（GIST882細(xì)胞）呈強(qiáng)ETV1表達(dá)。組織芯片（含156例標(biāo)本）的結(jié)果與組織標(biāo)本、細(xì)胞結(jié)果一致，表現(xiàn)為ETV1在間質(zhì)瘤組織中呈廣泛散在的細(xì)胞核表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，ETV1在胃GIST中的表達(dá)較為多見，與年齡、性別等無(wú)關(guān)(P＞0.05)。同時(shí)，ETV1的表達(dá)與KIT表達(dá)密切相關(guān)，差異有顯著性(P＜0.05)，從不同危險(xiǎn)程度分級(jí)上看，ETV1在低中危GIST的表達(dá)略低于KIT，但是在高危組明顯高于KIT表達(dá)。
　　利用

10、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分別轉(zhuǎn)入3條ETV1 siRNA，qRT-PCR法檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后ETV1 mRNA水平變化。三條序列三個(gè)時(shí)間段的抑制率分別為:siRNA-A57.4％、63.0％、78.4％; siRNA-B37.5％、52.7％、65.5％; siRNA-C29.6％、46.1％、55.7％，較對(duì)照組mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)。抑制效率以siRNA-A序列轉(zhuǎn)染72h最佳。Westem blot進(jìn)一步證實(shí)siRN

11、A-A能較好沉默ETV1蛋白表達(dá)，故選擇siRNA-A組進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:ETV1表達(dá)下調(diào)抑制GIST882細(xì)胞的增殖(P＜0.05)。細(xì)胞周期結(jié)果提示:ETV1表達(dá)下降后，G0-G1期比例上升，S期比例下降，與Control組和Negative組相比具有明顯差異。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示ETV1表達(dá)下調(diào)促進(jìn)GIST882細(xì)胞的凋亡，而Negtive組和Control組之間無(wú)顯著性差異。通過western blot

12、檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)ETV1表達(dá)后Ras、p-c-Raf、 p-MEK、p-ERK的表達(dá)水平明顯受到抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。但是總的c-Raf、 MEK、ERK沒有明顯的改變。
　　結(jié)論：
　　ETV1在胃腸道間質(zhì)瘤組織、胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系（GIST882細(xì)胞）中普遍高表達(dá)。siRNA沉默ETV1基因能夠顯著抑制GIST882細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。沉默ETV1基因后，Ras、p-c